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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）的病原体,对猪的发病率及死亡率有显著影响,尤其是对于新生仔猪,致死率极高;猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种猪肠道冠状病毒,可引起仔猪腹泻脱水等症状,临床表现与PEDV相似,影响新生仔猪成活率,给养殖场带来较大的经济损失;PEDV、PDCoV感染成年猪往往无症状表现或症状轻微,可不治而愈,但成年猪在感染期间可持续带毒排毒,生猪还存在跨区域调动及交易运输,这使得其危害性更为隐秘,猪场PEDV、PDCoV感染更加难以控制和清除。猪嵴病毒（Porcine kobuvirus,PKV）是近年来新发现的一种病毒性病原体,最早是在腹泻粪便中被发现,截止到目前还没有PKV成功分离的报道,但PKV在有腹泻症状的猪群中检出率很高,还存在与PEDV的混合感染,推测PKV与猪腹泻疾病有关联,对宿主是否有致病性也需进一步研究。为全面了解山东省猪场PEDV、PDCoV和PKV的流行和病毒遗传变异情况,为猪场腹泻疫病防控提供理论依据和技术支撑,我们开展了以下工作:首先,从2020年9月至2021年7月,我们从山东省9个生猪主要养殖区（济南市、德州市、潍坊市、滨州市、济宁市、菏泽市、聊城市、东营市、淄博市）收集外表健康（无典型消化道/呼吸道临床症状）成年猪样品共1268份;经过样品处理和总RNA提取,利用检测引物对三种病原进行RT-PCR检测;随后,我们对鉴定的PEDV、PDCoV和PKV阳性样品利用引物扩增抗原基因全长序列;最后,我们以Gen Bank中公布的毒株序列作为参考,分别对获得的4株PEDV的S基因、1株PDCoV的S基因和2株PKV的VP1基因进行核苷酸、氨基酸（Amino acid,aa）序列同源性分析和遗传演化分析,我们还对PEDV、PDCoV S蛋白和PKV VP1蛋白进行了N-糖基化位点预测。此外,我们还利用了病毒宏基因组技术对3A2和6C3肺组织样品分别进行物种丰度分析和全基因组测序,对宏基因组技术在猪场临床检测中的应用进行了初步探讨。结果发现,从山东省收集的1268份样品中,PEDV检出率为4.42%（56/1268）;PDCoV检出率为0.47%（6/1268）;PKV检出率为1.18%（15/1268）;其中,PEDV阳性样品来自潍坊市、德州市、济南市养殖场和屠宰场,PDCoV阳性样品来自潍坊市养殖场,PKV阳性样品来自德州市、济南市养殖场和屠宰场。PEDV与PDCoV混合感染样品（来自潍坊市）总体阳性率为0.24%（3/1268）;PEDV与PKV混合感染样品（来自德州市）总体阳性率为0.07%（1/1268）;未检出PDCoV与PKV混合感染样品,也未检出PEDV、PDCoV和PKV三重混合感染样品。上述试验结果表明,外表健康的猪群也可能携带一种或多种病毒,存在带毒排毒的风险;3种病原体中,PEDV在我省猪场外表健康成年猪群中最为流行且存在与其它病原体的混合感染。基于PEDV抗原基因S基因的系统发育分析发现,本研究发现的山东PEDV流行株CHN-SDC65-2020、CHN-SDG12-2021和CHN-SDG38-2021属于GII-a亚群,CHN-SDG58-2021属于S-INDEL大群;4株PEDV流行株与中国CV777疫苗株基于S基因的核苷酸同源性为93.5%～95%、氨基酸同源性为92.3%～94.4%;与中国疫苗株CV777相比,4株PEDV流行株在COE基因中和表位区多个氨基酸位点出现氨基酸突变aa522位A→S、aa554位T→S、aa599位G→S、aa638位Q→E,在SS6区域aa769位L→S、aa771位D→S;4株PEDV流行株S蛋白预测到22～23个N-糖基化位点。试验结果表明,CHN-SDC65-2020、CHN-SDG12-2021和CHN-SDG38-2021流行株与近年来国内外分离的PEDV GII型变异毒株的关系更为密切,CHN-SDG58-2021流行株具有遗传差异性,与以美国USA/OH851毒株为代表的S-INDEL分支的毒株关系更密切;4株PEDV流行株与中国疫苗株CV777的同源性较低且N-糖基化潜在位点存在很大的差异;4株PEDV流行株S蛋白氨基酸位点存在替换、插入和缺失,氨基酸突变位点主要集中在S1区域。本研究发现的山东PDCoV流行株CHN-SDG25-2021在遗传进化上属于中国分支,但与中国最早从香港发现的PDCoV毒株HKU15-44相比,其S蛋白检测到多达21处氨基酸突变;CHN-SDG25-2021与中国参考毒株S基因核苷酸/氨基酸序列同源性分别为96.8%～98.3%、96.6%～99.1%,而与国外参考毒株核苷酸/氨基酸同源性分别为95.9%～97.9%、96.7%～98.4%;与美国/日本/韩国、老挝/越南/泰国谱系毒株相比,CHN-SDG25-2021 S蛋白上有两处独特氨基酸替换,分别是aa510位N→I和aa534位K→E,其S蛋白预测到18个N-糖基化位点。试验结果表明,CHN-SDG25-2021流行株表现出明显的区域特征,CHN-SDG25-2021与中国其它PDCoV毒株的亲缘关系比与东南亚、美国、日本、韩国的毒株更为密切,遗传进化上与中国毒株相似;此外,PDCoV S蛋白氨基酸差异性分析表明CHN-SDG25-2021流行株突变位点主要集中在S1区域。PKV有3个抗原基因VP0、VP1和VP3,据以往研究报道,VP1基因是3个抗原基因中最易发生变异的。基于PKV VP1基因的系统发育分析发现,PKV可以分为中国I组、中国Ⅱ组、泰国-日本组和匈牙利组4个分支,本研究发现的CHN-SDC71-2020与CHN-SDG14-2020流行株处于中国II组分支;CHN-SDC71-2020和CHN-SDG14-2020与中国参考毒株VP1基因核苷酸同源性为81.4%～85.8%,氨基酸同源性为87%～92.9%,与泰国/日本/匈牙利参考毒株核苷酸同源性为80.4%～84.8%,氨基酸同源性为85%～90.6%;此外,与泰国、日本、匈牙利参考毒株和中国以往分离的PKV毒株相比,CHN-SDC71-2020 VP1蛋白有5处氨基酸突变,CHN-SDG14-2020 VP1蛋白有9处氨基酸突变;2株PKV流行株VP1蛋白均预测到1个N-糖基化位点。试验结果表明,本研究发现的山东PKV流行株CHN-SDC71-2020和CHN-SDG14-2020亲缘关系较近且两者遗传进化上同属中国II组分支,但与中国II组分支其他毒株的核苷酸和氨基酸序列差异较大,提示PKV处于快速抗原变异之中。通过对猪肺组织样品3A2的宏基因组测序和数据分析,我们在3A2样品中发现了12个RNA病毒科（包括正粘病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科等）以及19种RNA病毒（包括甲型流感病毒、人腺病毒C型、丙型肝炎病毒等）;通过宏基因组测序和数据分析,我们从6C3样品获得了1株甲型流感病毒（命名为A/swine/shandong/6C3/2019）的8个基因片段（包括PB1、PB2、HA、NA等）序列,HA、NA基因系统发育进化树显示其属于类禽类H1N1亚型猪流感病毒。以上试验结果表明,在猪的肺组织中存在多种病毒混合感染;人腺病毒的存在表明猪是人兽共患病病原体的潜在宿主;此外,本研究对宏基因组技术的初步应用表明,宏基因组技术有助于发现猪场中存在的病毒,为猪场疫病诊断提供重要参考。综上所述,本研究结果表明山东省猪场外表健康猪群中也存在PEDV、PDCoV和PKV流行,并存在混合感染情况;系统发育分析表明,大部分山东省PEDV、PDCoV和PKV流行株由中国毒株遗传变异而来,少部分PEDV流行株可能源于境外输入;本研究结果发现,与国内其他省份的流行株相比,山东省PEDV、PDCoV和PKV流行株的抗原基因上存在不同程度的氨基酸突变、缺失和插入,表明山东省的PEDV、PDCoV和PKV毒株表现出进化多样性和独特性,流行株N-糖基化潜在位点的差异可能对病毒的抗原性存在影响;本研究还表明宏基因组技术可用于猪场临床样品的诊断,有助于全面了解猪场存在的致病微生物混合感染情况。本研究阐明了山东省猪场外表健康成年猪群中PEDV、PDCoV和PKV的流行情况,分析了山东省PEDV、PDCoV和PKV流行株的抗原基因遗传演化情况,应用宏基因组技术揭示了猪肺中病毒的混合感染情况并获得毒株的全基因组序列,为山东省猪腹泻疫病防控提供了流行病学数据参考和理论依据,提示应加强对猪场外表健康猪群的监测,研发多联多价疫苗以阻断多种病毒的混合感染,降低疫情风险。