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冠状病毒是自然界中普遍存在的一大类家族,其感染谱极为广泛,包括人和多种动物。冠状病毒的宿主广泛性及基因组的结构特征使其在进化过程中极易发生变异,因此新亚型及新的冠状病毒不断出现。猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是新发现的猪腹泻类冠状病毒,主要感染仔猪,引起仔猪严重的肠炎并伴有水样腹泻和呕吐等症状,同猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的临床症状相似且临床上PDCoV和PEDV混合感染情况较严重,给养猪业造成了巨大的经济损失,因此对PDCoV和PEDV快速检测方法的研究以及流行毒株的遗传变异分析工作是防控该类疫病的首要任务。本试验首先建立了PEDV、PDCoV的单重荧光定量RT-PCR,然后建立了PEDV和PDCoV的双重荧光定量RT-PCR方法并初步应用于临床样品的检测中。同时对PDCoV河南株CH-01进行了全基因组序列测定,并进行遗传变异分析,为下一步进行PDCoV CH-01株的生物学特性研究以及致病性研究奠定了基础。(一)参照GenBank中登录的PDCoV基因组序列,设计并合成了1对N基因的特异性引物,成功地从PDCoV CH-01毒株中扩增出长260 bp的PDCoV N基因片段,并构建了PDCoV N基因片段的重组质粒,经测序验证后,将重组质粒10倍倍比稀释后进行SYBR Green I荧光定量RT-PCR,并对反应体系和反应条件进行了优化。结果显示循环值(Cq)与重组质粒的对数之间有良好的线性关系;动力学曲线分析表明该方法可最低检测到PDCoV 54拷贝/μL,特异性试验表明与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒II型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无交叉反应。PDCoV荧光定量RT-PCR方法的建立,为临床检测和监测PDCoV感染奠定了基础。(二)参照GenBank中登录的PEDV N基因序列,设计并合成了1对N基因的特异性引物,应用PCR扩增出PEDV N基因298 bp的片段,构建重组质粒,将重组质粒10倍倍比稀释后进行SYBR Green I荧光定量RT-PCR,并对反应体系和反应条件进行了优化。结果显示Cq值与重组标准品质粒的对数之间有良好的线性关系,相关系数R~2为0.99;动力学曲线分析表明该方法最低检测线为57拷贝/μL;该方法对TGEV、PCV2、PRV、PRRSV和猪细小病毒(PPV)检测为阴性,显示出较好的特异性;用建立好的荧光定量RT-PCR扩增方法重复扩增3次,结果表明组内和组间变异系数均小于1%。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,可以定量、定性对PEDV进行检测。(三)在建立的PDCoV和PEDV单重SYBR Green I荧光定量RT-PCR基础上,通过对反应条件的优化,最终建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,即利用一次SYBR Green I荧光定量RT-PCR可同时检测PDCoV和PEDV。通过对该方法的灵敏性、特异性和重复性分析发现,PDCoV最低检测量是28.6拷贝/μL、PEDV最低检测量是99.6拷贝/μL;同时对TGEV、PRRSV、PRV、PCV2检测均为阴性。试验结果表明,本试验建立的双重荧光RT-PCR技术能够同时快速检测PEDV和PDCoV,为这两种疾病的诊断提供了技术支持。(四)为了解河南省PDCoV的遗传变异情况,参考GenBank发表的PDCoV全基因序列,设计合成了13对具有重叠的特异性引物,将PDCoV河南株CH-01全基因组进行分段扩增,并对其进行测序拼接。结果表明河南株CH-01全基因组长25 426 bp,编码基因顺序为5’-ORF1a/b-S-E-M-NS6-N-NS7-3’,全基因与其他PDCoV毒株全基因核苷酸同源性在98.5%~98.8%,氨基酸同源性为97.3%~98.1%。ORF1基因核苷酸与国内外其他毒株同源性在在98.4%~98.8%,S基因的核苷酸与国内外其他毒株的同源性在98.7%~99.1%,其他结构基因的核苷酸同源性在95.0%~99.7%。通过PDCoV全基因组和ORF1基因的遗传进化分析表明,国内所有的PDCoV均处于一个大的分支,表示目前国内外所流行的PDCoV是一个型;进一步分析显示河南株PDCoV CH-01独立处于一亚分支上。但通过对PDCoV S基因、M基因和N基因等主要结构基因的遗传变异分析,显示PDCoV CH-01株和所有的中国毒株处于一个亚分支上,而所有的国外毒株处于另外一个亚分支上。因此PDCoV河南株CH-01是否已发生变异有待进一步研究。本试验建立的PEDV、PDCoV单重荧光定量RT-PCR,PEDV和PDCoV双重荧光RT-PCR方法为这两种疾病的鉴别诊断及混合感染提供了一种有效的分子生物学诊断方法。通过对河南株PDCoV的全基因测序分析,为进一步研究PDCoV的生物学特性、基因结构分析和蛋白功能研究提供了理论基础。