猪肠道冠状病毒长期危害养猪业的健康发展,主要引起仔猪腹泻和死亡,给养猪业造成巨大的经济损失。猪传染性胃肠炎（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪δ冠状病毒（PDCo V）是最常见的三种猪冠状病毒,临床发病症状相似且伴有混合感染的情况,导致鉴别诊断较困难,急需更好的鉴别诊断技术。基因芯片检测技术具有多种优点,特别适合多种疫病的同步快速鉴别诊断。本研究利用生物信息学方法分析Rd RP（RNA-dependent RNA polymerase）基因并设计了一对同时检测TGEV、PEDV和PDCo V的通用PCR引物,同时根据这三种病毒的扩增子差异序列分别设计芯片检测探针,建立了快速鉴别TGEV、PEDV和PDCo V三种病毒的基因芯片技术,并用该技术对以四川省为主的三种猪冠状病毒开展了流行病学调查。1.TGEV-PEDV-PDCo V通用引物基因芯片检测方法的建立通过比对三种猪冠状病毒标准株的全基因组序列选择冠状病毒高度保守的Rd RP基因作为靶基因,设计通用引物序列,都能获得395bp的扩增子;针对每种病毒的这段扩增子差异序列设计2条Oligo序列作为寡聚核苷酸探针;分别对检测芯片的PCR退火温度,芯片探针点制浓度、探针水合条件、杂交缓冲液成分、杂交条件和Cut-Off值进行优化。最终确定通用引物PCR退火温度为59℃;探针浓度为第1组探针20μmol、第2组探针50μmol;水合的条件为37℃10h或50℃2h;杂交缓冲液的配比为6×SSC、5×Denhardt、0.5%SDS和100 mg/m L鲑鱼精DNA;杂交条件为43℃1h;Cut-Off值为信噪比≥4.363判为阳性。同时评价该共检芯片的特异性、敏感性、重复性和保存期等,结果显示芯片仅能检出这三种病原,有较高特异性,检测PDCo V、PEDV和TGEV的灵敏度分别为101copies/μL、101 copies/μL和102 copies/μL,批间和批内检测的SNR变异系数小于10%,最佳保存期为60天;最终设计得到一套较为完整的基因芯片检测程序。2.TGEV-PEDV-PDCo V通用引物基因芯片检测方法的应用本研究用建立的TGEV-PEDV-PDCo V共检基因芯片开展了以四川地区为主三种冠状病毒的流行病学调查,并与国标检测方法进行比较,结果显示:对田间样本的检测与国家标准之间的平均符合率为85.2%,检测四川等地区共计406份样品,总阳性率为44.08%,流行病学调查结果表明在四川地区的猪冠状病毒腹泻以PEDV单独感染为主,样品中的PEDV阳性率为42.6%,绵阳、成都、宜宾等地冠状病毒性流行较为严重。综上,该新型TGEV-PEDV-PDCo V通用引物检测基因芯片可用于三种冠状病毒检测,具有良好的潜在应用前景。