【摘 要】
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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是引起仔猪急性腹泻的主要猪肠道冠状病毒。PEDV与PDCoV共感染现象在猪群中很普遍,严重影响养猪业的健康发展,但PEDV与PDCoV协同感染的临床结果尚不清楚。在本研究中,我们将PEDV与PDCoV按不同的接种顺序感染4日龄健康
【基金项目】
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国家重点研发计划“猪δ冠状病毒感染与致病机制研究（2021YFD1801103-4）”； 河南省杰出青年基金“猪δ冠状病毒宿主适应性及其分子机制（202300410192）”； 河南省高校科技创新人才支持计划（21HASTIT039）； 国家重点研发计划“猪肠道病原微生物共感染与协同致病机制（20
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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是引起仔猪急性腹泻的主要猪肠道冠状病毒。PEDV与PDCoV共感染现象在猪群中很普遍,严重影响养猪业的健康发展,但PEDV与PDCoV协同感染的临床结果尚不清楚。在本研究中,我们将PEDV与PDCoV按不同的接种顺序感染4日龄健康仔猪,通过体重变化、腹泻情况和组织病理学评估,建立了PEDV与PDCoV共感染的动物模型;然后通过对仔猪的粪便排毒、组织病毒载量、组织病理学变化、炎症细胞因子表达和结肠微生物组成结构的分析,研究了PEDV与PDCoV共感染对仔猪致病性的影响;最后分析了PEDV与PDCoV体外共感染猪树突状细胞（Dendritic cells,DC）诱导炎性因子表达的情况。本研究为PEDV与PDCoV共感染致病机制的研究奠定了基础。具体研究内容如下:1.PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型的建立试验选取30头4日龄健康仔猪,随机分成6组:对照组、PDCoV组、PEDV组、PEDV/PDCoV组（PEDV先感染12 h再感染PDCoV）、PDCoV-PEDV组（PEDV和PDCoV同时感染）和PDCoV/PEDV组（PDCoV先感染12 h再感染PEDV）,每组5头仔猪。PDCoV组的仔猪口服病毒液5×10~7 TCID50/头,PEDV组的仔猪口服病毒液1×10~8 TCID50/头,共感染组仔猪口服PDCoV 5×10~7 TCID50和PEDV 1×10~8 TCID50/头,对照组的仔猪口服细胞培养液。在试验期间,每天观察仔猪的临床症状,并记录仔猪体重和腹泻情况。在感染后第3天,每组选取3头仔猪进行剖检,观察仔猪的病理剖检情况,采集心、肝、脾、肺、肾、小肠（十二指肠、空肠和回肠）、大肠（结肠、盲肠和直肠）组织,用q RT-PCR检测病毒的组织分布情况,用H＆E染色对小肠进行组织病理学检查,计算小肠绒毛高度与隐窝深度比值（VH:CD）。结果显示,与PDCoV或PEDV单独感染组相比,3组PEDV与PDCoV共感染仔猪的腹泻程度更严重,腹泻时间明显延长,体重增加显著减缓。选择PEDV与PDCoV同时感染组仔猪进行进一步检测,结果显示共感染组的仔猪小肠明显变薄、肠绒毛萎缩、坏死和脱落,仔猪小肠绒毛萎缩程度显著高于单独感染仔猪。q RT-PCR结果显示PEDV与PDCoV在小肠组织的病毒载量较高。以上结果表明我们成功建立了PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型。2.PEDV与PDCoV共感染对仔猪协同致病性的研究在成功建立PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型的基础上,开展PEDV与PDCoV共感染致病性研究。PEDV与PDCoV共感染仔猪后,通过q RT-PCR检测仔猪粪便和小肠组织中病毒含量,免疫组织化学检测仔猪小肠组织中病毒分布,利用ELISA测定仔猪血清中炎性因子的含量,应用16S r RNA测序分析仔猪结肠微生物组成结构变化。结果显示与PEDV与PDCoV单独感染组相比,共感染组仔猪粪便和小肠组织中PDCoV载量显著升高（p＜0.01）,且主要分布于小肠绒毛上皮细胞,但是PEDV的病毒载量在各感染组之间差异不显著。在病毒感染后3天（dpi）,PEDV与PDCoV共感染比单独感染仔猪血清中炎性因子（IL-6、IL-8和TNF-α）分泌量显著增加（p＜0.01）。16S r RNA对3 dpi仔猪结肠内容物测序发现,与对照组相比,PEDV与PDCoV共感染组和单独感染组仔猪的结肠微生物结构发生显著改变。在属水平上,与单感染组相比,共感染组的光冈菌属（p＜0.001）和柯林斯氏菌（p＜0.05）属丰度显著增加。Spearman相关性分析显示光冈菌属与TNF-α和IL-6分泌呈正相关。以上结果表明PEDV与PDCoV共感染仔猪存在协同致病性。3.PEDV与PDCoV共感染DC对炎性因子表达的影响在PEDV与PDCoV共感染能够加重仔猪肠道损伤和炎性因子表达的基础上,进一步开展PEDV与PDCoV共感染DC对炎性因子表达的影响。从猪外周血中分离诱导出未成熟DC,用PEDV与PDCoV共感染DC,通过q RT-PCR和间接免疫荧光检测（IFA）等技术研究PEDV与PDCoV在DC上的感染以及对炎性因子表达的影响。结果显示PEDV与PDCoV在感染DC后3-12 h病毒拷贝数均显著升高,并在24 hpi开始下降;上清中病毒滴度在3-24 hpi持续上升,并且在24 hpi最高。IFA结果显示在单独感染组和共同感染组中均检测到PEDV与PDCoV抗原。与单独感染组相比,PEDV与PDCoV共感染DC后细胞中炎性因子（IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8）表达量显著升高。以上结果表明PEDV与PDCoV可以体外共感染DC并显著促进炎性细胞因子的表达。综上所述,本研究成功建立了PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型,发现PEDV与PDCoV存在协同致病作用,可加重仔猪的肠道组织损伤;同时,PEDV与PDCoV可以体外共感染DC并显著促进炎性细胞因子的表达。本研究为PEDV与PDCoV共感染致病机制的研究奠定了基础。
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