大部分豆科植物的根部可以被根瘤菌入侵从而诱导植物高效固氮根瘤的发育。豆科植物与根瘤菌共生互作具有较高专一性,其中一个原因取决于根瘤菌调控因子NodD蛋白对豆科植物根部分泌的类黄酮混合物的响应。大量遗传学实验证据表明,NodD蛋白可能作为特异性受体识别类黄酮化合物来激活下游结瘤基因的表达,最终诱导结瘤因子的生物合成。结瘤因子进而被植物受体蛋白识别启动了豆科植物结瘤信号转导。然而,根瘤菌NodD蛋白对类黄酮的响应大都是基于遗传实验数据间接推测出来的,并没有生化证据表明NodD蛋白是类黄酮的直接受体。本文借助生化手段研究了根瘤菌中NodD蛋白与不同类黄酮小分子之间的互作机制。本研究从本实验室保存的菌株中选择了6种根瘤菌,包括大豆根瘤菌、苜蓿根瘤菌以及日本百脉根根瘤菌。克隆了其中的nodD1和nodD2基因。我们选取较为常用的4种类黄酮小分子化合物,即柚皮素、染料木素、大豆苷元和木犀草素,研究了它们与NodD蛋白的互作。利用等温滴定量热法（ITC）测定了NodD蛋白及不同缺失突变的NodD蛋白与4种类黄酮小分子互作过程中产生的热量变化。基于热量的变化推断识别类黄酮小分子的关键位点位于NodD蛋白的C端。将这些不同突变形式的nodD基因导入突变体菌株Sinorhizobium fredii HH103 nodD2中,基于大豆结瘤表型研究NodD蛋白中关键位点的生物学功能。主要实验结果如下:1.将克隆得到的12个nodD基因构建到蛋白表达载体上,在此基础上通过氨基酸序列比对以及NodD蛋白三级结构的预测,我们分别在S.fredii HH103根瘤菌的nodD1基因和nodD2基因C端设计了4个缺失氨基酸位点,4个缺失位点分别为128F-132P、146V-152P、192S-198P和246P-249L,并将得到的4个缺失基因构建到蛋白表达载体上在原核系统中进行蛋白表达。经过对蛋白表达条件的不断优化和筛选,最终得到了表达良好的NodD1和NodD2蛋白。2.ITC实验数据表明缺失氨基端序列128F-132P、146V-152P、192S-198P和246P-249L可能都参与了NodD2蛋白对柚皮素和染料木素的识别;128F-132P、146V-152P和246P-249L则参与了NodD2蛋白对大豆苷元的识别。木犀草素（非匹配类黄酮）不能被NodD1与NodD2蛋白特异性识别。3.为了验证上述4个关键位点的生物学功能,通过三亲本杂交和双亲本杂交实验成功敲除S.fredii HH103中的nodD2基因获得了S.fredii HH103 nodD2基因的插入突变体—S.fredii HH103ΩnodD2。分别将4个缺失的nodD2基因以及全长nodD2基因回补至S.fredii HH103ΩnodD2菌株中,接种大豆并检测结瘤表型。在S.fredii HH103ΩnodD2突变体和回补菌株的表型中,发现它们在大豆根部的结瘤数目低于野生型,表明这些位点在结瘤固氮中起重要作用。综上,我们基于前人对NodD蛋白与类黄酮小分子互作进行的的一些遗传性质分析,利用ITC等技术手段在体外验证NodD蛋白与类黄酮互作的分子机制,并得到了一些关键性位点,因此可以通过基因基因敲除、基因突变等手段改变其序列,为根瘤菌的宿主专一性机制的认识增加了新证据。