全球肝癌的发病率和死亡率居高不下,但目前对于晚期肝癌依然没有很好的治疗手段。近年来,有关嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗的基础和临床研究取得了重大进展。临床研究表明,CAR-T在血液瘤的治疗上效果显著,但对实体瘤的治疗效果并不理想。实体瘤复杂的组织病理学结构以及强大的免疫抑制环境都限制了CAR-T功能的发挥,尤其是CAR-T细胞难以浸润肿瘤成为限制CAR-T细胞治疗实肿瘤的最主要障碍。RUNX家族转录因子3（RUNX family transcription factor 3,RUNX3）作为一种重要的抑癌基因,在细胞生长、发育、凋亡和信号转导中发挥十分重要的作用。最近的研究发现,RUNX3是调节T细胞在非淋巴组织中的关键调控因子,能够促进CD8+T细胞向组织常驻记忆T细胞（Tissue resident memory T cells,TRM）分化,而TRM细胞具有很强的肿瘤组织浸润能力,参与肿瘤的免疫监视,抑制肿瘤的生长。因此,本论文拟通过在靶向肝癌细胞的CAR-T细胞上共表达RUNX3分子,增强CAR-T细胞浸润肿瘤的能力,更好地发挥抗肿瘤作用。我们构建了靶向肝癌标志物磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC3）的慢病毒表达载体,并通过P2A序列串联了RUNX3基因序列,通过酶切验证和测序后,确定成功构建了GPC3-CAR与RUNX3共表达的CAR-T载体（RUNX3-P2A-GPC3-CAR）。进而利用经典的三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,制备病毒原液,经浓缩纯化后获得可用于CAR-T制备的高滴度慢病毒,感染T细胞后获得CAR阳性率大于30%的RUNX3-GPC3-CAR-T细胞,RT-PCR结果分析表明该CAR-T细胞中RUNX3的表达显著提高。为进一步明确RUNX3-GPC3-CAR-T的肿瘤杀伤能力,论文选择GPC3表达量较高的Hep G2和Huh7细胞开展进一步的研究。体外共培养实验表明,共表达RUNX3虽然没有显著改变CAR-T细胞的体外增殖,T细胞激活标志CD25和CD69的表达、细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌以及对靶细胞的杀伤,但流式细胞分析的结果表明RUNX3的表达可以显著降低经典的耗竭标志LAG3以及PD1在CAR-T细胞中的表达,延缓T细胞的耗竭。同时RUNX3还可以显著提高CD45RA-/CCR7+的中央记忆T细胞（Tcm）以及组织常驻记忆T细胞（TRM）的比例,预示着更好的体内存留时间和实体肿瘤组织的浸润能力。为了进一步评估共表达RUNX3的CAR-T细胞的动物体内抗肿瘤效果,用人肝癌细胞（Huh7-luci）在NSG免疫缺陷小鼠体内构建了肝癌移植瘤模型,实验结果表明共表达RUNX3增强了CAR-T细胞抗肿瘤效果,且延长了小鼠生存期,具有更好的体内抗肿瘤效果。综上所述,本论文设计和制备了一种共表达RUNX3靶向GPC3的增强型CAR-T细胞,体外细胞水平的研究表明RUNX3的表达不仅可以显著降低T细胞的耗竭,还能够提高Tcm和TRM细胞的比例,具有更好的体内持续和肿瘤组织靶向的潜能,并且具有更好的动物体内杀伤效果。我们的研究揭示了RUNX3在CAR-T细胞治疗,尤其是在实体肿瘤治疗中的应用前景,为进一步提高CAR-T对肝癌等实体肿瘤的治疗效果提供了理论依据。