基于片段的药物发现（FBDD）在过去十年中发展日益成熟,其基于结构导向的优化或活性片段之间的合理组合策略极大地推动了药物发现从偶然发现、机遇筛选到针对性选择、合理性设计的转变。与其它药物发现手段相比,FBDD有着分子筛选规模较小,但化学空间覆盖范围极广的优势。此外,命中片段结构的可延伸性提供了新颖且强大的分子成药方式,目前FDA已经批准了四种片段衍生药物。选择合理的受体靶标能赋予命中分子结构优化的潜力,而生物物理方法则是FBDD流程中命中发现和验证的核心,本论文中以二氢叶酸还原酶（DHFR）、RING型E3连接酶RNF55和RNF56作为片段筛选的受体靶标,采用差示扫描荧光法（DSF）、基于核磁共振的饱和转移差谱（STD）和荧光偏振法（FP）组成的正交筛选策略依次筛选片段,以此得到与受体蛋白有亲和力的片段分子。一、二氢叶酸还原酶是生物叶酸合成途径的关键酶,靶向二氢叶酸还原酶的叶酸结合口袋可影响细胞正常的碱基对合成,有研究表明叶酸途径与肿瘤细胞的新陈代谢联系紧密,阻断它可以达到治疗乳腺癌、肺癌、消化道癌等多种疾病的效果。以DHFR作为筛选靶点,利用大肠杆菌系统完成对蛋白酶的表达纯化。借助差示扫描荧光法和饱和转移差谱筛选含1201个分子的片段库。其中基于差示扫描荧光实验方法从片段库中初步鉴定了16个阳性分子,进一步采用STD实验验证了其中7个分子为正交命中,但亲和作用较弱。这些命中片段与叶酸类分子在结构上有相似之处,含有氮苯类、胺类等碱性基团。使用计算模拟对接方法进一步验证了5个命中片段与目的蛋白DHFR的相互作用是发生在叶酸结合口袋。二、RNF55作为一种RING型E3连接酶,介导蛋白酪氨酸激酶（PTKs）的泛素化降解,从而在信号转导通路的调控中发挥重要作用,是前列腺癌和骨髓增生性疾病的潜在药物治疗靶标,RNF55通过其保守的TKB结构域与底物结合,因此可以通过靶向TKB结构域中其磷酸酪氨酸酶结合位点,来筛选小分子抑制剂。实验中采用DSF、STD及FP三种方法依次筛选靶向RNF55的片段分子,使用差示扫描荧光实验筛选获得了11个命中片段,进一步以STD实验二次筛选得到1个正交命中,该片段含有硫代酰胺和苯环类基团,从荧光偏振实验的结果来看,产生的命中不是在TKB结构域中的磷酸酪氨酸结合位点,表明该化合物可能与RNF55的其它位点结合发生相互作用。三、RING型E3连接酶RNF56结构与RNF55相似,也是通过其TKB结构域中的磷酸酪氨酸酶结合位点发挥泛素化调节作用。筛选实验中经由DSF实验得到了7个阳性片段,再使用核磁共振实验确定了其中3个亲和作用片段。与受体蛋白结合的片段含有氯苯基、吗啉乙腈基团、嘧啶基团和乙酸基团等特征。本项目以重要生物学功能的蛋白DHFR、RNF55、RNF56为靶标,利用基因工程手段进行了表达、纯化和富集。采用基于生物物理的方法诸如差示扫描荧光法（DSF）、基于核磁共振的饱和转移差谱（STD）和荧光偏振法（FP）及计算模拟对接的方法,从已知片段库筛选获得若干个与靶蛋白相结合的片段分子,并获得了相应的结构特征,为进一步筛选相应的抑制剂或配体提供了实验基础,具有一定的理论和应用价值。