研究背景与目的腰痛（Low Back Pain,LBP）是现阶段临床上最为常见的几种慢性疾患之一,严重影响患者的日常生活,对患者造成生理和心理的损伤,并且给社会和患者带来巨大的经济负担。针对腰痛的具体病因,最常见的就是椎间盘退行性变（Intervertebral Disc Degeneration,IDD）。目前现在患者呈现出年轻化趋势,并且随着老龄化社会的到来,患者数量将会进一步的增多。当下针对IDD,因为对于IDD的具体发病机制仍不是十分明确,所以临床上缺乏有力的非手术治疗方案,但是手术同样也存在一些缺点:其不能从源头上真正改善椎间盘的退变情况,而仅能进行病变部位的切除,而且由于改变了脊柱部分节段原本的解剖,整个生物力学出现了一定的改变,从而造成相邻节段退变的几率明显增加。因此,探究IDD的具体机制对治疗椎间盘退行性变有着极为重要的意义。正常的椎间盘包括髓核、纤维环和软骨终板,外周的纤维环紧紧包绕着中央的髓核,并且上下附以软骨终板,整个结构类似于一个“三明治”,而且是全身最大的无血管神经区域,整个椎间盘处在一个低糖、低氧、低PH值,高渗、负荷波动的恶劣环境中。椎间盘退变进展中,炎症反应加重,水分不断丢失,整个高度逐渐下降,髓核向外周移动,逐渐导致压迫神经,从而引起腰痛。因为MRI对组织中的水分较为敏感,因此可在MRI的T2加权成像发现信号强度和椎间盘高度的降低,临床针对椎间盘退行性变常用的Pfirrmann分级也是依托于MRI下的影像学表现。目前研究表明在椎间盘的退变机制中,NP的退变是最为主要的,其主要的病理生理改变可以分为三大块:炎症的发生发展、细胞外基质的代谢失衡和细胞凋亡,其中炎症的发展和细胞外基质的代谢失衡又占主导地位。经典炎症因子IL-1β和TNF-α能明显诱导椎间盘退变。然而,它们存在于许多组织中,基本上缺乏组织特异性,因此基于它们的炎症治疗在应用于临床之前还需要克服许多问题。而细胞外基质的代谢失衡主要表现为合成端的减少和分解端的增加。40kda的几丁质酶3样蛋白1（CHI3L1）于1990年被首次发现和描述为由滑膜细胞分泌的高度保守的糖蛋白。CHI3L1基因由10个外显子组成,位于染色体1q31-q32上,产物CHI3L1/YKL-40由383个氨基酸组成。随着研究的深入,发现CHI3L1不仅仅可以由滑膜细胞分泌,还可以由其他多种细胞分泌,包括软骨细胞,骨肉瘤细胞,平滑肌细胞等。它的两大最主要功能是参与调控炎症反应以及组织重塑,但是目前对于CHI3L1在炎症反应中到底是发挥促炎作用还是促炎作用仍存在很大争议。此前有研究表明,在椎间盘退变中,NP组织中的CHI3L1表达水平明显增高,但是对于CHI3L1的具体作用机制并未进行研究。本课题组在前期研究中通过对正常和退变的髓核组织进行无标记蛋白质组学分析,发现在退变的髓核组织中CHI3L1的表达明显升高。因此,本课题基于上述基础,旨在对CHI3L1在椎间盘退变中的作用及其具体作用机制进行深入研究,为未来针对椎间盘退变的机制治疗提供相关理论基础。第一部分:椎间盘髓核组织中CHI3L1的表达水平方法:（1）根据Pfirrmann分级收集正常和退变的椎间盘组织,提取人的椎间盘内的髓核细胞。（2）通过使用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃含有5%的CO₂的环境下进行体外培养,每3天进行一次换液,培养至细胞融合80%后进行传代。（3）使用实时定量PCR法检测收集到的退变髓核细胞中相关基因的表达量。（4）对不同时期和状态下的小鼠椎间盘进行免疫组化分析。（5）通过分别使用炎症因子IL-1β（25ug/ml）和TNF-α（50ug/ml）干预72小时构建体外的髓核细胞退变模型后,收集两退变模型组以及空白对照组细胞的总RNA和总蛋白,并通过实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测不同组的CHI3L1的水平。（6）通过酶联免疫吸附剂测定分析在不同浓度炎症因子处理后椎间盘髓核细胞中的CHI3L1的蛋白水平。结果:（1）成功提取并在体外培养出形态优良的人来源的髓核细胞。（2）退变的椎间盘髓核细胞中,CHI3L1和ADAMTS4的水平明显升高,ACAN和CHSY1的水平明显下降。（3）通过免疫组化发现CHI3L1主要在髓核组织中表达。（4）通过实时定量PCR法和Western Blot技术检测发现两种不用炎症因子干预72小时后构建的退变模型组中CHI3L1的表达水平明显高于空白对照组中CHI3L1的表达水平。（5）ELISA技术发现随着炎症因子的浓度增加,CHI3L1的水平也在增加,直至达到饱和。结论:通过对人来源的原代细胞的培养获得了形态优良的呈梭型的椎间盘髓核细胞,CHI3L1主要在髓核中表达,具有髓核特异性。退变的髓核细胞中,无论是蛋白水平还是RNA水平,CHI3L1的表达水平均明显高于对照组。第二部分:CHI3L1对椎间盘退变的影响方法:（1）对收集到的人的原代髓核细胞进行体外培养。（2）验证设计的CHI3L1si RNAs的效率。（3）并分别进行CHI3L1过表达干预以及si RNA si CHI3L1转染,处理48h后,即实验组:正常髓核细胞进行CHI3L1过表达干预,正常髓核细胞进行si CHI3L1转染;对照组为未处理的正常髓核细胞。（4）此外,通过两种炎症因子分别构建体外椎间盘髓核细胞退变模型,并分别进行CHI3L1过表达干预以及si RNA si CHI3L1转染,处理48h后,即实验组:体外退变模型中的髓核细胞进行CHI3L1过表达干预,体外退变模型中的髓核细胞进行si CHI3L1转染;对照组为未处理的体外退变模型中的髓核细胞。（5）以上各组中的髓核细胞通过Trizol法收集各组髓核细胞的RNA,测定各组细胞的RNA量后通过Real-time技术检测不同基因的RNA表达量。（6）通过细胞迁移侵袭试验技术检测正常的髓核细胞组,体外退变的髓核细胞模型空白组,体外退变的髓核细胞模型进行CHI3L1过表达干预组以及体外退变的髓核细胞模型进行si CHI3L1转染组中MMP的表达量。结果:（1）成功建立体外培养的髓核细胞系4株。（2）设计的si CHI3L1转染后能够明显抑制髓核细胞中CHI3L1的水平。（3）无论在正常髓核细胞中还是体外椎间盘髓核细胞退变模型组中,CHI3L1过表达组中的MMP1、MMP3、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5表达量明显高于对照组,而si CHI3L1转染组则呈现相反的结果。（4）在正常髓核细胞组中,CHI3L1和si CHI3L1对ACAN、CHSY1和COL2的调控不明显,但是在体外椎间盘髓核细胞退变模型组中,发现过表达CHI3L1能够明显促进上述基因的表达,转染si CHI3L1则能够明显抑制上述基因的表达。（5）过表达CHI3L1明显抑制了髓核细胞的MMP的分泌量,而si CHI3L1明显促进了髓核细胞的MMP的分泌量。结论:获得人的正常髓核细胞株4株。通过Real-time PCR技术以及Transwell技术发现在体外椎间盘髓核细胞退变进展中,CHI3L1能够明显抑制炎症相关基因的表达,在开始阶段CHI3L1对基质相关基因的表达调控不明显,在一定炎症存在下,CHI3L1能够促进基质相关基因的表达。第三部分:CHI3L1通过上调AKT3保护椎间盘退变的机制研究方法:（1）通过高通量测序技术,寻找在椎间盘退变过程中CHI3L1作用的下游靶基因。（2）生物信息学分析CHI3L1保护椎间盘髓核细胞退变的机制。（3）通过q PCR筛选根据高通量测序分析后的IDD潜在下游靶基因。（4）通过体外Rescue挽救实验验证筛选出的CHI3L1下游靶基因。（5）通过重组蛋白和多克隆抗体调控髓核组织中CHI3L1蛋白水平,明确CHI3L1对下游靶基因的调控和对髓核组织的作用。结果:（1）通过使用高通量转录组测序技术,发现CHI3L1处理后的体外退变模型的髓核细胞转录组水平基因表达与对照组存在显著的差异。（2）对测序结果进行生信分析后发现潜在的下游靶基因。（3）通过q PCR筛选发现在椎间盘退变中,AKT3可能为CHI3L1的下游靶基因。（4）Rescue实验通过综合调控CHI3L1和AKT3水平提示在椎间盘退变中AKT3是CHI3L1的下游靶基因（5）重组蛋白调控后AKT3、p-AKT3以及AKT3下游激活,并且抑制了MMPs和ADAMTS4,促进ACAN、CHSY1等的表达情况,多克隆抗体调控后则明显相反,并且通过Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术发现重组蛋白调控后凋亡明显减弱,多克隆抗体调控后则凋亡显著增加。结论:在IDD中,CHI3L1具有抑制炎症、促进ECM合成以及抑制凋亡的作用。并且证实了CHI3L1是通过调控下游的AKT3信号才得以发挥上述作用。小结本研究首次研究了炎症相关基因CHI3L1在髓核细胞中的作用,通过免疫组化发现了CHI3L1在髓核细胞中特异性的表达,通过调控CHI3L1水平,发现CHI3L1能够抑制炎症相关基因的表达,并促进基质合成相关基因的表达。通过转录组测序并进行生信分析,首次发现在IDD中,AKT3是CHI3L1的潜在下游靶点,并通过Rescue实验验证。通过上述研究证明了CHI3L1通过作用于下游靶点AKT3,发挥着抑制炎症,促进细胞外基质合成以及抑制细胞凋亡的作用,从而保护椎间盘退变。