海洋放线菌产吲哚咔唑类生物碱的研究

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海洋放线菌因其特殊的生存环境形成了独特的代谢途径、生存繁殖方式和适应机制,从而产生结构独特的次级代谢产物,已成为了海洋活性天然产物的重要来源之一。吲哚咔唑是一类具有重要生物活性的天然生物碱,其良好的药理活性吸引了越来越多科研工作者的关注。本论文从海南文昌海域采集多种海洋样品,选用SC、M2、1/I0ATCC172三种培养基选择性分离到350株海洋放线菌,根据紫外吸收特征和HPLC指纹图谱筛选出13株产吲哚咔唑类生物碱的菌株,通过16S rRNA基因序列、MLSA多位点基因序列、发酵产物丰富度等比较分析,从中优选出菌株HNM0089进行代谢产物的分离、纯化、结构鉴定、活性评价、发酵条件优化及菌株分类鉴定。采用正相硅胶、反相硅胶、凝胶、高效液相等多种色谱方法从菌株HNM0089的代谢产物中分离到15个化合物,其中8个为吲哚咔唑类生物碱,其余7个为非吲哚咔唑类化合物。利用高分辨质谱、一维和二维核磁波谱技术确定了主产化合物TL-1为星形孢菌素staurosporine(STA),其余7个吲哚咔唑类化合物中TL-2、TL-3、TL-5、TL-6、TL-7为已知化合物,TL-4和TL-8为疑似新吲哚咔唑类化合物。生物活性测定表明,主产物TL-1对人肺癌细胞(A549细胞)、人白血病细胞(HL-60细胞)和人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)的IC50分别为2.061 nM、22.33 nM和398.6 nM,说明其具有良好的抗肿瘤活性,但对人正常肝细胞(L-02细胞)也表现出强烈的毒性,IC50达4.051 nM。此外,主产物TL-1对芒果炭疽病菌、薯蓣炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、橡胶炭疽病菌和香蕉枯萎病菌均有显著的抑制活性,MIC分别为0.125μg/mL、8 μg/mL、8 μg/mL、8 μg/mL和8 μg/mL,具有开发成农用抗菌素的潜力。通过16S rRNA基因序列系统发育分析,结合形态及生理生化特征比较分析将菌株HNM0089鉴定为弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae),并发现该株菌在14-45 ℃,pH 5-12的条件下均能生长,耐盐性达7.5%,同时生长所利用的碳源和氮源种类也十分广泛。选取可溶性淀粉、黄豆粉、酵母浸粉、碳酸钙和海盐五个变量因素,利用响应面实验设计方法优化了菌株HNM0089的发酵条件。最优培养基组成为:可溶性淀粉3.4%、黄豆粉0.5%、酵母浸粉0.3%、碳酸钙0.1%、海盐3.6%、pH 8.0,优化后星形孢菌素产量提高了 4.5倍,达到182.57 μg/mL,为后续结构修饰和农用抗菌素的开发利用奠定了物质基础。
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