论文部分内容阅读
羊口疮(Orf),又称为羊传染性脓疱(Contagious ecthyma,CE),是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引发的一种接触性和嗜上皮性的人畜共患病。ORFV主要感染绵羊、山羊,给养羊业造成了严重的经济损失,也对人类健康造成了威胁。ORFV全基因组约有131个基因,由中心编码区和2个相同的反向末端重复序列区构成。ORFV112基因位于反向末端重复序列区,编码趋化因子结合蛋白(Chemokine Binding protein,CBP)。ORFV112主要在病毒感染早期发挥作用,能够有效的与趋化因子表面受体结合,从而干扰宿主的免疫防御机制,抑制免疫因子活性,在病毒免疫逃避中发挥作用。1.利用Illumina Hiseq PE150测序平台,对ORFV-JL株进行全基因组测序分析,并对ORFV-JL株的理化性质进行研究。全基因测序结果表明,ORFV-JL株基因组全长139 279 bp,GC含量高达64.87%,共有131个ORF,所有ORFs占基因组全长的83.69%。ORFV-JL株对温度、酸碱度和氯仿敏感,对不同株系的细胞感染力不同。2.以ORFV基因组为模板,利用PCR技术扩增得到ORFV112片段,对ORFV112片段进行双酶切,将酶切后的ORFV112基因片段与原核表达载体pET28a(+)连接,构建pET28a-ORFV112重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导菌株表达,以SDS-PAGE和Westrn Blot检测。通过Ni-NTA柱将表达的ORFV-CBP融合蛋白进行纯化,用SDS-PAGE检测纯化的表达产物。结果表明,成功构建了pET28a-ORFV112重组质粒,经IPTG诱导后,含pET28a-ORFV112重组质粒的菌株成功表达了带His标签的融合蛋白,SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示,融合蛋白分子质量约为36 ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白存在于包涵体中。3.用纯化的ORFV-CBP融合蛋白作为抗原,皮下多点注射免疫白兔,制备兔抗ORFV-CBP多克隆抗体。用间接ELISA方法检测多抗的效价。结果表明,获得的多克隆抗体效价在1:25600以上。4.通过PCR反应扩增ORFV112基因,与pEGFP-N1真核表达质粒连接,构建pEGFP-N1-ORFV112重组质粒,转染293T细胞,经荧光显微镜观察,流式细胞仪检测,qRT-PCR检测和Western Blot鉴定。结果表明,成功构建了pEGFP-N1-ORFV112重组质粒,表达了ORFV-CBP融合蛋白,为研究ORFV-CBP的功能奠定了基础。5.利用Illumina Hiseq测序平台,对过表达ORFV-CBP融合蛋白的293T细胞和对照组293T细胞进行RNA-seq测序,在转录本层次研究ORFV-CBP对细胞的影响。测序完成后,通过样本间的表达量的差异,筛选出192个显著差异转录本与ORFV-CBP的表达相关,对其进行GO功能分类,共获得11个参与免疫过程的差异转录本,qRT-PCR验证结果表明,有9个差异转录本验证结果和RNA-seq测序结果相一致。为后续研究ORFV-CBP对基因转录后调控机制的影响奠定了基础。