心功能不全作为各种心血管疾病发展的终末阶段,已成为严重的公共健康问题。研究表明,心肌细胞死亡是心功能不全进程中的重要因素,即使少量的心肌细胞死亡都会引起心脏电活动或机械活动紊乱,导致心功能障碍。然而,目前诱导心肌细胞死亡的原因和机制还需进一步阐明。β1肾上腺素受体（β1-adrenergic receptor,β1-AR）过度激活可引起心肌细胞死亡。研究表明,超过50%的心功能不全患者血清中可检测到针对β1-AR细胞外第二环抗原肽段产生的β1肾上腺素受体自身抗体（β1-adrenergic receptor autoantibodies,β1-AA）。β1-AA可引起β1-AR持续激活促使心肌细胞死亡和心功能下降。然而,β1-AA引起心肌细胞死亡的机制尚未完全阐明。自噬作为细胞的一种自我保护机制,可消化、降解细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器,使长寿命蛋白质或受损的细胞器再循环利用,维持细胞稳态。一旦自噬过程遭到破坏,受损的蛋白质和细胞器不能被及时清除会在细胞中累积,影响心肌细胞正常功能和结构。有研究表明,降低自噬水平可以诱导心肌细胞死亡,进而导致左心室扩张和收缩功能障碍。由此可见,自噬功能下降是引起心肌细胞死亡进而促进心功能不全的关键因素。然而,近年来有研究发现,Beclin1+/-杂合小鼠或心肌特异性过表达m TOR抑制心肌自噬功能后,心肌对压力超负荷诱导的心功能不全起保护作用,提示在某些情况下,抑制心肌自噬功能反而可起到心肌保护作用。由此看来,自噬功能降低对于心肌细胞死亡的作用存在矛盾之处。因此,自噬功能本身并不是影响心肌细胞死亡的唯一机制。近年来研究发现,自噬在哺乳动物SCN,心脏,肝脏,肾脏,骨骼肌等组织也存在昼夜节律性波动。自噬节律通过调节其降解并重利用蛋白质和细胞器的时间间隔来维持内环境的稳态。之前的Beclin1+/-杂合小鼠或心肌特异性过表达mTOR小鼠模型只是单纯的抑制自噬功能,并未影响心肌自噬节律,因此,我们推测自噬节律紊乱可能是心肌细胞死亡发生的关键因素。但是,目前尚无研究表明在心肌细胞中β1-AA抑制自噬功能的同时是否影响自噬节律,以及自噬节律的变化对于心肌细胞死亡是否有影响。因此,本研究拟证明β1-AA对于心肌自噬节律的影响及其在心肌细胞死亡中的作用,寻找心功能不全进程中心肌细胞死亡的新机制。第一部分:β1肾上腺素受体自身抗体可诱导心功能不全发生研究目的:使用生物信息学分析验证心功能不全患者左心室β1肾上腺素受体信号通路是否发生异常;构建主动免疫小鼠动物模型,探究β1-AA对小鼠心功能的影响;β1-AA作用于心肌细胞,探究其是否会引起心肌细胞死亡。实验方法:1.数据下载与可视化处理:GEO数据库中下载正常左心室样本与心功能不全患者左心室样本的高通量测序信息;2.GO,KEGG富集分析:采用R语言进行富集分析;3.合成抗原肽段:由上海吉尔生化有限公司合成;4.建立β1-AA主动免疫模型:将β1-AR-ECⅡ注射于C57BL/6小鼠和SD大鼠的背部皮下;5.SA-ELISA:检测主动免疫后C57BL/6小鼠和SD大鼠血清中β1-AA的含量;6.亲和层析法:纯化大鼠血清中的β1-AA;7.小鼠心脏超声:检测不同组小鼠的心功能;8.CCK8法:检测β1-AA作用后,心肌细胞的存活情况。结果:1.生物信息学分析筛选出正常人群和心功能不全患者左心室心肌组织样本中的差异表达基因,将差异基因进行KEGG信号通路富集分析发现心功能不全患者心肌组织肾上腺素受体信号通路Gene Ratio较高;2.GO富集分析发现β1肾上腺素受体信号通路相关基因在心功能不全进程中发挥重要作用;3.小动物超声结果显示,β1-AA可引起小鼠心脏收缩功能和舒张功能显著降低;4.CCK8结果显示,β1-AA可引起H9c2心肌细胞死亡率显著增高。结论:1.心功能不全患者的基因组信息发生重排,重排后的基因组中β1肾上腺素受体信号通路相关基因显著异常;2.β1-AA可诱导心肌细胞死亡及心功能下降。第二部分:β1-AA可引起心肌自噬节律紊乱研究目的:自噬通过包裹,降解,再利用受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器来维持心脏正常的结构和功能。我们前期研究结果表明,β1-AA通过持续激活β1-AR,抑制心肌自噬功能促进心肌细胞死亡。然而,又有研究报道,心肌自噬功能被抑制后反而发挥心功能保护作用。可见,自噬功能本身并不是影响心肌细胞死亡的唯一机制。研究发现,心肌自噬存在昼夜节律性波动,这种昼夜节律的变化也可能是造成心肌细胞死亡的重要原因。然而,目前尚无研究表明β1-AA抑制心肌自噬功能的同时是否会改变其昼夜节律。因此,本部分实验将探究β1-AA对心肌自噬节律的影响。实验方法:1.KEGG富集分析:通过R语言进行KEGG富集分析;2.SA-ELISA:详见第一部分;3.亲和层析法:详见第一部分;4.荧光定量PCR（Real time-PCR）:检测心肌组织和心肌细胞中自噬标志物LC3 mRNA的节律性表达情况;5.Western blot:检测心肌组织和心肌细胞中自噬标志物LC3蛋白的节律性表达情况。结果:1.KEGG富集结果显示,心功能不全患者左心室肾上腺素受体信号通路异常与Circadian entrainment信号通路相关;2.荧光定量PCR和Western blot结果显示,LD环境中,β1-AA可引起心肌组织自噬节律发生破坏,以ZT12较为显著;3.荧光定量PCR和Western blot结果显示,DD环境中,β1-AA可引起心肌组织自噬节律发生破坏,以CT8,CT12较为显著;4.荧光定量PCR和Western blot结果显示,β1-AA可引起心肌细胞自噬节律发生破坏,其中在CT12自噬水平降低较为显著。结论:1.心功能不全患者左心室Circadian entrainment信号通路发生异常;2.β1-AA诱导心肌组织自噬节律紊乱;3.β1-AA诱导H9c2心肌细胞自噬节律紊乱。第三部分β1-AA通过引起心肌自噬节律紊乱诱导心肌细胞死亡研究目的:为了探究自噬节律紊乱在心肌细胞死亡中的作用,本部分实验采用慢病毒沉默生物钟核心基因Per2破坏心肌细胞自噬节律,检测心肌细胞的存活率;并用抗原中和抗体恢复心肌细胞自噬节律,再观察β1-AA对心肌细胞存活率的影响。实验方法:1.荧光定量PCR（Real-time PCR）:检测生物钟核心基因Per2 m RNA昼夜节律变化情况,以及慢病毒抑制Per2 mRNA的效率。各组心肌细胞LC3mRNA昼夜节律变化情况;2.Western blot:检测生物钟核心基因Per2蛋白昼夜节律变化情况,以及慢病毒抑制Per2蛋白的效率。各组心肌细胞LC3蛋白昼夜节律变化情况;3.慢病毒感染:采用1/2小体积法进行慢病毒感染;4.ABC-ELISA:采用ELISA试剂盒检测H9c2心肌细胞上清cAMP活性;5.CCK8法:检测各组细胞的存活率。结果:1.荧光定量PCR和Western blot结果显示,β1-AA诱导心肌组织生物钟核心基因Per2昼夜节律紊乱;2.荧光定量PCR和Western blot结果显示,β1-AA破坏H9c2心肌细胞生物钟核心基因Per2昼夜节律;3.激光扫描共聚焦显微镜观察显示MOI=30时,LV-shPER2的感染效率最高,故选用MOI=30用于后续实验;荧光定量PCR和Western blot结果证明LV-sh PER2感染H9c2心肌细胞后可显著抑制Per2的表达;4.荧光定量PCR和Western blot结果显示,LV-shPER2感染H9c2心肌细胞可引起心肌细胞自噬节律发生破坏;5.CCK8结果显示自噬节律破坏可诱导心肌细胞存活率显著降低;6.ABC-ELISA检测结果显示,抗原中和抗体可抑制β1-AA对下游通路c AMP的激活作用;7.荧光定量PCR和Western blot结果显示,抗原中和抗体可逆转β1-AA在CT12时对自噬节律的破坏作用;8.CCK8结果显示大鼠H9c2心肌细胞的自噬节律恢复后细胞存活率有所回升。结论:自噬节律紊乱是β1-AA诱导心肌细胞死亡的重要原因。