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研究背景:高血压（hypertension）是以体循环动脉血压持续升高（≥140/90 mm Hg）为主要表现的一类临床综合征。高血压所并发的左心室肥厚是最为常见的高血压靶器官损害之一。高血压诱发的左心室肥厚可使心血管疾病的发病及死亡风险升高2倍以上,其已成为临床预测心血管疾病总死亡率的强预测因子。因此,逆转高血压所导致的左心室肥厚是降低临床心血管事件发生风险,并提高患者生存率的最有效途径。压力负荷型心肌肥厚是长期血压增高导致的慢性病理损伤。目前,临床上主要通过药物治疗将患者血压控制在正常范围,以此来延缓心肌肥厚乃至心力衰竭的发生;然而,左心室肥厚并不会因为血压水平的降低而发生完全逆转,在血压达标的患者中仍有高达20%的人存在左心室肥厚,提示:压力负荷型心肌肥厚可能存在未知的发病机制。因此,寻找针对左心室肥厚的更加有效的治疗措施就势在必行。间充质干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的多能干细胞。研究发现,间充质干细胞可以在心脏受损后,定向归巢到损伤部位,并在这些部位存活、增殖、分泌细胞因子,发挥调节炎症反应的作用。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs）是一种来源广泛,免疫原性低,无伦理问题限制的干细胞类型;其在体外培养时,可稳定生长、细胞均一性较好,同时对多种损伤,如:神经损伤、心肌缺血、骨质疏松及自身免疫性疾病等均有良好的修复作用,作为一种新型种子细胞,其具有更广阔的应用前景。那么,h UC-MSCs对心肌肥厚是否有良好的缓解能力,同时,经腹腔和静脉进行干细胞移植的疗效有无差别;如果h UC-MSCs对压力负荷型心肌肥厚有效的话,其可能的调节机制是什么?尚缺乏有效的实验证据。综上所述,本项目以脐带间充质干细胞为切入点,通过腹腔及尾静脉注射两种方式进行干细胞移植治疗小鼠心肌肥厚。观察h UC-MSCs是否对心肌肥厚小鼠的心功能、心肌肥厚程度、局部炎症反应、微血管再生以及心室重构进程等有影响;然后进一步在细胞水平探讨h UC-MSCs是否可以直接抑制药物诱导的心肌肥大;并通过h UC-MSCs与RAW264.7巨噬细胞共培养,探讨h UC-MSCs抑制心肌肥厚的可能机制。通过以上的研究,旨在为后期h UC-MSCs应用于临床心肌肥厚病人的治疗,提供可行的移植方式及理论和实验依据。目的:本研究以人脐带间充质干细胞为切入点,通过不同移植途径,观察h UC-MSCs移植治疗小鼠心肌肥厚的疗效,并对h UC-MSCs抑制心肌肥厚的可能机制进行了探索。方法:（1）采用主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）构建C57BL/6J小鼠心肌肥厚模型,通过测量左室质量/体重、心重/肺重,评价模型是否建立成功。（2）模型建立成功后,h UC-MSCs通过尾静脉（TAC+MSCs-iv）以及腹腔（TAC+MSCs-ip）注射移植入小鼠体内连续治疗4周,对照组给予等量PBS（TAC+PBS）,观察h UC-MSCs对各组小鼠生存率,心功能（超声心动图）,心肌肥厚指标（心重/体重比、心重/肺重比、心重/胫骨长比、左室质量/体重比、心肌组织ANP、BNP和β-MHC蛋白含量）,心电轴偏移（心电图）,心肌细胞横截面积大小（HE染色）,心肌胶原容积分数（Masson三色染色）,微血管再生情况（CD31免疫组化染色）,炎症细胞浸润情况（CD45免疫组化染色）以及巨噬细胞分布（CD68免疫组化染色）的影响。（3）在离体实验中,首先对复苏后的人脐带间充质干细胞相关表面抗原的表达（流式细胞术）及h UC-MSCs分化成骨（茜素红染色）、成脂（油红O染色）能力进行鉴定。然后通过异丙肾上腺素（isopropyl adrenaline,ISO）诱导H9c2细胞肥大,并将h UC-MSCs与肥大的H9c2细胞共培养于Transwell TM小室中,观察共培养48h后,h UC-MSCs对H9c2细胞面积（F-actin染色）、H9c2细胞内ANP、BNP和β-MHC m RNA表达量（q RT-PCR）的影响。（4）使用IFN-γ+LPS诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,IL-4诱导RAW264.7巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。使用Transwell TM小室完成h UC-MSCs与诱导极化后的RAW264.7细胞共培养,观察h UC-MSCs对RAW264.7细胞极化分型（M1型巨噬细胞鉴定:CD68+CD86免疫荧光染色,M2型巨噬细胞鉴定:CD68+CD206免疫荧光染色）以及分泌炎症因子TNF-α、IL-10（ELISA）的影响。结果:（1）TAC术后第4周,与假手术组（左室质量/体重:3.06±0.21;心重/肺重:0.78±0.01）相比,模型组左室质量/体重（5.58±0.47）、心重/肺重（1.00±0.04）均明显增加（P<0.01）,提示小鼠心肌肥厚模型成功建立。术后11周时,TAC+MSCs-ip组生存率（83.33%）与同期TAC+PBS组（70.59%）相比呈上升趋势,但无显著差异（P>0.05）,TAC+MSCs-iv组生存率（70.59%）与同期TAC+PBS组相比无明显差异。超声心动图结果证实:术后第10周,与同期TAC+PBS组相比（LVEF:28.92±0.64%;LVFS:14.85±0.22%）,TAC+MSCs-ip组LVEF（45.59±1.43%）、LVFS（23.19±0.86%）及TAC+MSCs-iv组LVEF（45.23±1.18%）、LVFS（21.91±1.47%）均明显升高（P<0.05）;与同期TAC+PBS组（7.28±0.04 mm）相比,TAC+MSCs-ip组LVID,d（5.87±0.11 mm）及TAC+MSCs-iv组LVID,d（6.66±0.02 mm）均明显降低（P<0.05）。（2）将心重/体重比（HW/BW）、心重/肺重比（HW/LW）、心重/胫骨长比（HW/TL）、左室质量/体重比（LVM/BW）作为衡量心肌肥厚程度的指标,结果显示:TAC术后第10周,TAC+MSCs-ip组小鼠HW/BW（8.69±0.87）、HW/LW（0.83±0.07）、HW/TL（11.11±0.67）、LVM/BW（3.57±0.14）均明显低于同期TAC+PBS组（HW/BW:10.00±0.19;HW/LW:1.18±0.04;HW/TL:14.92±0.80;LVM/BW:5.56±1.86,P<0.05）;TAC+MSCs-iv组小鼠HW/LW（0.93±0.04）、LVM/BW（3.90±0.44）亦明显低于同期TAC+PBS组（P<0.05）。（3）心电图结果发现:术后第11周,TAC+MSCs-ip组（-37.76±4.66°）及TAC+MSCs-iv组（-55.68±1.76°）小鼠的心电轴左偏较TAC+PBS组（-89.11±0.32°）均明显减轻（P<0.05）。（4）术后第10周,HE染色结果显示:TAC+MSCs-ip及TAC+MSCs-iv组小鼠出现心肌细胞肥大、间质增加、纤维断裂等情况均明显弱于同期TAC+PBS组（P<0.05）;Massson染色结果显示:TAC+MSCs-ip及TAC+MSCs-iv组小鼠心肌纤维化面积分别为17.06±0.65μm2、18.64±0.76μm2,均小于PBS组（24.51±0.59μm2,P<0.01）;免疫组化染色结果显示:与TAC+PBS组（1.00±0.57个/10×视野）相比,TAC+MSCs-ip（5±0.57个/10×视野）及TAC+MSCs-iv（2.33±0.33个/10×视野）组小鼠心肌均出现明显的的毛细血管增生（P<0.05）;同时,小鼠心肌组织中CD45阳性细胞占比、巨噬细胞的数量在TAC+MSCs-ip组（23.48±0.44%,10.40±0.46%）及TAC+MSCs-iv组（26.28±0.57%,13.44±0.56%）明显低于同期TAC+PBS组（28.73±0.83%,19.47±0.60%,P<0.05）;Western blot结果显示:从第9周开始,与同期TAC+PBS组（ANP:2.50±0.06;BNP:2.99±0.07;β-MHC:1.46±0.03）比较,在TAC+MSCs-ip组（1.36±0.03,1.56±0.12,0.79±0.03）和TAC+MSCs-iv组（1.81±0.10,1.88±0.06,1.11±0.03）小鼠心肌组织中ANP、BNP及β-MHC蛋白含量均显著下降（P<0.01）。（5）流式细胞术结果提示:复苏后的人脐带间充质干细胞高表达MSCs相关的标记（CD90、CD73、CD105的标记表达均为阳性）,而CD45、CDl9、CD31、CD34和CD11b、HLA-DR等内皮细胞特异性抗原及移植排斥相关的细胞表面标记表达则为阴性。茜素红、油红O染色结果证实:复苏后的人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,可以成功分化为骨和脂肪组织。F-actin染色结果显示:与对照组（7151.10±33.53μm2）相比,与h UC-MSCs共培养48h后的H9c2细胞面积明显减小（4915.93±75.18μm2,P<0.01）;同时,q RT-PCR结果显示:H9c2细胞中ANP（1.07±0.02）、BNP（1.52±0.13）和β-MHC（1.31±0.06）m RNA水平明显少于对照组（ANP:1.26±0.05,BNP:1.66±0.04,β-MHC:1.44±0.03,P<0.05）。（6）CD68+CD86免疫荧光染色鉴定M1型巨噬细胞及CD68+CD206免疫荧光染色鉴定M2型巨噬细胞,免疫荧光染色结果显示:与未共培养的对照组（M1型:46.79±1.39%,M2型:51.16±1.43%）相比,与h UC-MSCs共培养48h后,诱导极化的RAW264.7巨噬细胞向M1型（CD68、CD86阳性）极化比例（37.18±0.85%）明显减少,而向M2型（CD68、CD206阳性）极化比例（66.15±1.15%）明显增多（P<0.05）。ELISA结果显示:相较于对照组上清液中炎性因子的含量（TNF-α:83.24±0.87 pg/m L;IL-10:51.63±0.64 pg/m L）,与h UC-MSCs共培养48小时之后,诱导极化的RAW264.7细胞上清液中M1型巨噬细胞相关因子TNF-α含量明显降低（71.43±0.70 pg/m L,P<0.05）,与M2型巨噬细胞相关的因子IL-10的含量明显增加（65.07±0.94 pg/m L,P<0.05）。结论:经腹腔和尾静脉移植人脐带间充质干细胞治疗小鼠心肌肥厚,可显著缓解压力负荷型心肌肥厚的发生,改善小鼠心功能,其机制可能与减少心肌细胞肥大相关基因表达、促进细胞因子分泌、微血管生成以及巨噬细胞向M2型分化增多有关。