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心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）在中老年人中频发。其中心力衰竭（Heart failure,HF）是大多心血管病的终末期。慢性心力衰竭时心脏交感神经末端功能降低,其变化与心肌细胞神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）下调相关。心力衰竭与缺氧和氧化应激增加有关。氧化应激介导心力衰竭时心脏交感神经末梢功能异常,心肌β肾上腺素能受体下调和心肌细胞凋亡。NADPH氧化酶是活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生的主要来源。然而,心力衰竭时心肌细胞NGF下调的机制及其对心肌细胞凋亡的影响尚不明确。本课题将探究是否NADPH氧化酶激活介导心肌细胞NGF下调导致心肌细胞凋亡及其机理。我们首先采用体外培养H9C2心肌细胞,构建缺氧（Hypoxia）模型,观察是否缺氧和活性氧介导NGF下调;然后,采用NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素（apocynin）,研究是否NADPH氧化酶介导缺氧诱导的NGF下调致心肌细胞凋亡;最后用NGF受体酪氨酸蛋白激酶A（Tyrosine receptor kinase A,Tr KA）抑制剂K252a干预,探究是否NADPH氧化酶源性的活性氧通过NGF受体Tr KA信号通路介导心肌细胞凋亡。本论文包括3部分:第一部分:缺氧和活性氧介导心肌细胞NGF表达下调目的:观察缺氧时活性氧是否介导心肌细胞NGF下调。方法:构建H9C2心肌细胞缺氧6h模型。分组1:（1）对照组（Control）（2）缺氧组（Hypoxia）,蛋白应迹法检测NGF;分组2:（1）对照组（Control）（2）过氧化氢组（H2O2,终浓度100uM）（3）过氧化氢组（H2O2,终浓度500uM）,蛋应迹法检测NGF。结果:与对照组（Control）相比,缺氧组（Hypoxia）NGF表达下降。与对照组（Control）相比,过氧化氢组（H2O2）干预可诱导NGF的下降,在100uM时,下降最明显。第二部分:NADPH氧化酶介导缺氧诱导的NGF下调致心肌细胞凋亡。目的:研究NADPH氧化酶是否介导缺氧诱导的NGF下调致心肌细胞凋亡。方法:构建H9C2心肌细胞缺氧6h模型。分组1:（1）对照组（Control）（2）缺氧组（Hypoxia）（3）缺氧+NADPH氧化酶抑制剂apocynin组（Hypoxia+apocynin）,NADPH氧化酶试剂盒和谷胱甘肽试剂盒分别测NADPH氧化酶活性和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比率（L-Glutathione/glutathione disulfide,GSH/GSSG）;分组2:（1）对照组（Control）（2）缺氧组（Hypoxia）（3）缺氧+NADPH氧化酶抑制剂apocynin组（Hypoxia+apocynin）,蛋白应迹法检测NGF、Caspase3、Cleaved caspase3、Bax、Bcl-2。结果:与对照组（Control）相比,缺氧组（Hypoxia）NADPH氧化酶活性增高,GSH/GSSG比率下降,提示氧化应激增加。NADPH氧化酶抑制剂apocynin干预减轻缺氧所致NADPH氧化酶活性增加和GSH/GSSG比率下降。与对照组相比,缺氧组NGF蛋白表达降低,apocynin干预减轻缺氧致NGF表达降低,提示NADPH氧化酶激活介导NGF下调。进一步研究结果表明,与对照组相比,缺氧组Cleaved caspase 3、Bax和Bax/Bcl-2比率升高,Bcl-2蛋白表达轻度降低,apocynin干预减轻缺氧引起的Cleaved caspase3、Bax、Bax/Bcl-2升高和Bcl-2降低。这些研究结提示NADPH氧化酶激活介导心肌细胞NGF下调与心肌细胞凋亡增加有关。第三部分:NADPH氧化酶源性活性氧通过NGF受体Tr KA信号通路介导心肌细胞凋亡。目的:NADPH氧化酶源性的活性氧是否通过NGF受体Tr KA信号通路介导心肌细胞凋亡。方法:构建H9C2心肌细胞缺氧6h模型。分组1:（1）对照组（Control）（2）缺氧组（Hypoxia）（3）缺氧+NADPH氧化酶抑制剂apocynin组（Hypoxia+apocynin）,蛋白应迹法检测Tr KA;分组2:（1）对照组（Control）（2）缺氧组（Hypoxia）（3）缺氧+NADPH氧化酶抑制剂apocynin组（Hypoxia+apocynin）（4）缺氧+NADPH氧化酶抑制剂apocynin+Tr KA抑制剂K252a组（Hypoxia+apocynin+K252a）,流式检测各组凋亡率和坏死率。结果:与对照组（Control）相比,缺氧组（Hypoxia）Tr KA蛋白表达下降的,apocynin抑制了缺氧组（Hypoxia）致Tr KA的降低;进一步结果表明,与对照组（Control）相比,缺氧组（Hypoxia）心肌细胞凋亡率和坏死率升高,NADPH氧化酶抑制剂apocynin显著抑制了缺氧导致心肌细胞凋亡率和坏死率升高,K252a消除了apocynin的保护作用。提示NADPH氧化酶源性活性氧通过NGF受体Tr KA信号通路介导心肌细胞凋亡。结论:缺氧和ROS介导心肌细胞NGF表达降低;NADPH氧化酶激活介导缺氧诱导心肌细胞NGF下调,NGF表达降低与心肌细胞凋亡有关;NADPH氧化酶源性ROS通过NGF受体Tr KA信号通路介导心肌细胞凋亡。