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海带（Saccharina japonica）是我国大规模栽培的经济海藻,具有很高的应用和生态价值。由于近海海水污染、养殖管理不善、苗种种质退化等原因,海带苗期病害频繁发生,造成了较大经济损失。本文以对海带育苗期病害进行了调查,对幼苗绿烂病的病原进行了分离、鉴定和回接感染实验,进一步建立了2种病原的检测方法,检测了病原侵染过程中海带苗生理生化指标,以期为海带苗期的病原学研究提供理论和技术支持。本研究首先对海带育苗期发生的病害（包括孢子体畸形病、绿烂病）进行了调查,分离鉴定发病幼苗和健康幼苗的可培养细菌,并对发病时育苗池的水质因子进行检测;从分离菌株之中筛选潜在致病菌,对海带幼苗进行回接感染实验并检测发病过程中总蛋白含量（Total protein,TP）、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,以下简称SOD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,以下简称PPO）四个生理生化指标的变化;对2种病原菌进行了多位点序列鉴定,建立了其PCR定性检测方法。具体的研究内容和结果如下:1.海带育苗期孢子体畸形病及绿烂病害调查及可培养细菌的分离鉴定。山东威海某育苗场在2018年、2019年、2020年育苗期间均发生了海带孢子体畸形病,经检测孢子体畸形病发病时育苗池水体水质因子符合育苗规程（GB 11607和NY 5052）的要求。对患病海带孢子体进行可培养细菌的分离鉴定,发现分离菌株大多集中在α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）中,其中α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）中分离得到的菌株最多。Yangia始终为分离总菌株中的优势菌属,分别占历年总菌数的45.6%、25.4%、18.8%,其次为Alteromonas、Thalassospira、Stappia、Pseudoalteromonas等属。2018年山东威海某育苗场及2020年山东蓬莱某育苗场均出现海带幼苗绿烂病,经检测发现这两起绿烂病均与营养盐的不当添加有关。前者硝酸盐含量（30～35 mg/L）和磷酸盐含量（2.10～2.20 mg/L）均显著高于海带育苗规程建议用量10倍以上;后者硝酸盐含量（0.720±0.114 mg/L）不足规程标准的1/5,磷酸盐含量（1.291±0.034 mg/L）高于标准用量3倍以上。对两处的育苗海水及病苗均进行了细菌分离和16S rRNA基因序列的鉴定。从威海某育苗场的病苗中分离出优势菌属Yangia、Pseudoalteromonas和Glaciecola,从蓬莱育苗场病苗及育苗池海水中分离的优势菌属为Pseudoalteromonas、Thalassotalea、Polaribacter,虽然在不同年份、不同地域的绿烂病调查中,优势菌属组成存在差异,但均分离出较高比例的Pseudoalteromonas,这些结果说明其可能与海带幼苗绿烂密切关联。2.细菌回接感染实验确定幼苗绿烂病病原。首先对2018-2020年流行病学调查中采集到的菌株与现阶段已报道病原菌进行比对,筛选出潜在的病原菌,包括Pseudoalteromonas属的SJ-2-W-1、SJ-H-W-1、SJ-H-W-9、SJ-H-3,Halomonas属的Q-H-8、Q-H-26、Q-H-28、Q-H-66、Q-2-1,Tenacibaculum属的SJ-2-W-9、SJ-2-W-10以及Vibrio属的SJ-H-20。然后用12株菌株对成体海带叶片进行创伤感染实验,发现在感染浓度为108cfu/m L时,SJ-H-W-1、SJ-H-W-9、SJ-H-3、SJ-2-W-1、Q-H-66可在创伤感染7天内引起成体海带绿烂。选择引起海带病烂较严重的SJ-2-W-1（Pseudoalteromonas）和Q-H-66（Halomonas）进行海带幼苗细菌感染实验,在育苗规程要求的养殖条件下,感染浓度为105-107cfu/m L的细菌能引起海带幼苗的绿烂,发病率随细菌浓度增加而增加,107cfu/m L的细菌可海带幼苗100%发生病烂。对各组绿烂的海带组织进行细菌分离和优势菌的16S rRNA基因序列分析,优势菌与SJ-2-W-1的16S rRNA基因序列的同源性为100.0%,与Q-H-66同源性分别为99.97-100%。这些结果表明SJ-2-W-1和Q-H-66是引起海带幼苗绿烂的致病菌。显微观察显示发病初期,原本充盈整个细胞内的褐色色素体开始缩小,细胞中出现空隙;随着感染的不断加深,色素体进一步缩小,颜色由褐色变为绿色,且向细胞边缘游离;发展至感染末期,病灶处细胞全部变绿,严重处细胞内色素体缩小至颗粒状,呈蓝白色,分散在细胞各处,病变细胞呈现空壳化。感染症状与病害调查时绿烂症状相同。在感染过程中检测了海带的4个防御酶活指标（总蛋白含量、总抗氧化能力、SOD、PPO）。SJ-2-W-1感染组的总蛋白含量在感染前期无明显变化,感染中期呈显著下降趋势;总抗氧化能力与SOD活性变化均为先升高后降低;PPO活性较对照组呈现上升趋势。Q-H-66感染组的总蛋白含量在整个感染过程始终处于较低水平;总抗氧化能力高于对照组,呈现先升后降趋势终;SOD活性在感染初期急剧下降后无明显变化;PPO活性同SJ-2-W-1感染组的PPO活性变化相同。菌株SJ-2-W-1实验组与Q-H-66实验组呈现不同的变化趋势,可能存在不同的致病机制。3.海带幼苗绿烂病病原检测方法的建立。使用多位点序列分析法（MLSA,Multilocus Sequence Analysis）将SJ-2-W-1鉴定为Pseudoalteromonas carrageenovora,Q-H-66鉴定为Halomonas cupida。针对这两株菌的管家基因（dna A,rec A,fts Z,sec A）设计特异PCR引物,进行特异性和灵敏度检测。结果显示,fts Z基因的引物对Pfts ZF/Pfts Z482R对SJ-2-W-1（Pseudoalteromonas carrageenovora）的特异性强,sec A基因的引物对Hsec A215F/R对Q-H-66（Halomonas cupida）的特异性强,每反应可检测菌落下限可达2.7 cfu和9 cfu,每反应可检测细菌基因组DNA下限分别为8.1×102fg/μL、1.2×102fg/μL。本论文研究结果为我国海带流行病学调查提供了基础数据,为海带苗绿烂病的监测提供了技术支撑。