【摘 要】
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自2010年以来,我国罗氏沼虾养殖业出现以性早熟和生长缓慢为主要特征的“铁虾”现象。近几年,“铁虾”的比例仍然居高不下,严重制约了我国罗氏沼虾养殖业的绿色发展。为探索罗氏沼虾“铁虾”的致病机理,采用高通量测序平台Illumina Hiseq-2500分别对罗氏沼虾“铁虾”和正常罗氏沼虾的眼柄进行转录组测序。结果显示,转录组测序共获得56.42 G高质量数据,拼接后得到221901条Unigene,
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自2010年以来,我国罗氏沼虾养殖业出现以性早熟和生长缓慢为主要特征的“铁虾”现象。近几年,“铁虾”的比例仍然居高不下,严重制约了我国罗氏沼虾养殖业的绿色发展。为探索罗氏沼虾“铁虾”的致病机理,采用高通量测序平台Illumina Hiseq-2500分别对罗氏沼虾“铁虾”和正常罗氏沼虾的眼柄进行转录组测序。结果显示,转录组测序共获得56.42 G高质量数据,拼接后得到221901条Unigene,其中103570条得到注释。2003个基因在“铁虾”眼柄中差异表达,包括1209个上调基因和794个下调基因。差异表达分析显示催乳素、雌激素、胰岛素、促性腺激素释放激素、胰高血糖素、催产素、谷氨酸能突触、5-羟色胺能突触等与生殖调控相关激素和神经递质的代谢过程在“铁虾”与正常虾眼柄之间存在差异。此外,一些已被证明在免疫反应中起重要作用的基因在“铁虾”眼柄中显著上调,如C型凝集素、凝集素、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、甲壳素4等。516个基因被注释到242条KEGG通路中,注释到溶酶体、吞噬体、抗原呈递处理、细胞凋亡、内吞作用等多条与免疫相关的途径,提示罗氏沼虾“铁虾”存在病原感染。我们对“铁虾”样品进行了8种虾类主要病原的检测,但均未检出阳性。通过对患病虾的不同组织进行组织病理学观察,在与复眼神经和内分泌功能相关的多种组织细胞的细胞质中发现了嗜酸性包涵体。随后从“铁虾”样本中提取了病毒滤过液并进行了感染实验,感染后的罗氏沼虾出现了“铁虾”的症状,而对照组正常。结合组织病理学的结果,我们推断“铁虾”是由病毒引起的。进一步对感染实验和流行病学调查样品进行了宏转录组测序,发现一种新病毒存在于所有“铁虾”样品中,而在正常虾样本中未发现。经5’/3’RACE和Sanger测序验证,该病毒基因组全长12630 nt,为正义单链RNA病毒。经预测含有两个独立的开放阅读框（Open reading frame,ORF）,ORF1（1530 aa）和ORF2（2134 aa）。在5561到5685位置有一个短的基因间区域（125 nt）,在5518–5524位置发现了一个潜在的-1核糖体移码阅读（-1 programmed ribosomal frameshifting,-1 PRF）位点,可产生一个大小为3707 aa的多蛋白。通过对RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,Rd RP）和NS3保守结构域的系统发育分析表明,该病毒可能属于荆门病毒和黄病毒属之间的一个新属。利用透射电镜,可观察到直径40-60 nm的球形病毒颗粒。原位杂交结果显示,杂交信号出现在“铁虾”的复眼中,与组织病理学结果一致。我们建议将这种病毒命名为传染性早熟病毒（infectious precocious virus,IPV）,并提出了crustaflavirus infeprecoquis nov.gen.,nov.sp.的拉丁名建议。为准确、快速地检测IPV,根据IPV的基因组建立了RT-PCR和基于Taq Man探针的实时荧光定量PCR的检测方法。实验证明,这两种PCR方法均对IPV具有高特异性,与罗氏沼虾野田村病毒、黄头病毒、偷死野田村病毒、坦布苏病毒和正常罗氏沼虾的RNA无交叉反应。实时荧光定量PCR的检测下限低至1×100copies/反应,标准曲线表明在1×100～1×109 copies/反应的相关系数为R2=0.999,回归方程为y=-3.406lgx+37.053。重复性实验证明在1×100～1×108copies/反应梯度范围内的变异系数小于2%。通过临床样品验证,两种方法检出的阳性与临床症状相符。因此,这两种方法可用于IPV的特异性检测和净化。综上所述,本研究对罗氏沼虾“铁虾”和正常罗氏沼虾的眼柄进行了转录组分析,除鉴定出许多与生殖调控相关的差异表达基因及途径外,还发现多个在甲壳动物先天免疫反应中起重要作用的基因在性早熟罗氏沼虾眼柄中的表达量上升,暗示可能有病原微生物的感染,为解析罗氏沼虾“铁虾”的成因和分子机制奠定了基础。通过感染实验、病毒宏转录组测序、透射电镜观察、原位杂交等技术发现一种黄病毒科的新病毒可导致罗氏沼虾性早熟,提出了一个新属名crustaflavirus nov.gen.和一个新拉丁名crustaflavirus infeprecquis nov.gen.nov.sp.的建议。根据IPV基因组建立了针对该病毒的高特异性和灵敏性的RT-PCR和实时荧光定量PCR的检测方法,为罗氏沼虾“铁虾”的有效防控和净化工作提供了技术支撑。
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