哈维氏弧菌感染下半滑舌鳎肾脏转录组分析和白细胞介素12免疫应答的初步研究

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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属于舌鳎科舌鳎属,是一种具有高经济价值的海水养殖鱼类。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是高密度工厂化养殖过程中,引起细菌性疾病的主要病原体之一,对半滑舌鳎养殖造成了严重的经济损失,严重制约了半滑舌鳎高密度工厂化养殖产业的发展。本研究利用高通量测序技术,对半滑舌鳎感染哈维氏弧菌过程中不同时间节点的肾脏样本进行了转录组测序,探究了半滑舌鳎感染哈维氏弧菌感染过程中免疫应答的实时差异。之后对半滑舌鳎组成白细胞介素12(Interleukin 12,IL-12)基因的p35a亚基和p40c亚基进行了鉴定和免疫应答初步研究。本研究获得的结果如下:在半滑舌鳎感染哈维氏弧菌的过程中,通过转录组测序发现了相邻时间节点的比较中共有1297个差异表达基因,有406个差异表达基因在感染96h仍旧发生差异表达。这些基因主要参与非特异性免疫,包括补体、细胞因子及其相关受体。之后,我们对差异表达基因进行了GO(Gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome)富集分析中,发现这些差异基因主要分布在43个信号通路中,在信号转导、免疫系统和信号分子与相互作用通路中主要富集。结合转录组数据富集到的信号通路中的重要细胞因子,选定了半滑舌鳎的IL-12基因进行了后续研究。鉴定了半滑舌鳎组成IL-12其中一种亚型。IL-12由p35亚基和p40亚基两部分组成,基因编码区序列长度分别为651 bp和984 bp,分别编码216和327个氨基酸,预测蛋白质的分子量分别为24.11k Da和37.78 k Da,理论等电点分别为7.49和6.57。系统进化树分析表明,鉴定到的半滑舌鳎p35亚基属于鱼类的p35a亚基;鉴定到的半滑舌鳎p40亚基属于鱼类的p40c亚基。氨基酸同源性分析表明半滑舌鳎的p35a亚基与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的相似性最高;半滑舌鳎的p40c亚基与三棘刺鱼(Gasterosteus aculeatus)相似性最高,分别为52.04%和48.67%。同源建模半滑舌鳎P35a和P40c的蛋白质三级结构的结果表明,半滑舌鳎的P35a蛋白含有较多的α螺旋,是P35亚基的典型四螺旋拓扑结构;半滑舌鳎的P40c蛋白则含有较多的β折叠;P35a蛋白和P40c蛋白以类似于配体和受体结合的方式,共价结合形成异源二聚体。组织表达分析显示p35a在鳃、脑、心和卵巢中表达量较高,p40c在肝、脾、鳃和心中表达量较高。通过哈维氏弧菌感染实验,分析了半滑舌鳎p35a、p40c及其相关基因(ifn-γ、il-10)在哈维氏弧菌感染过程中的表达模式。p35a在脾中,48 h表达显著上升(p<0.05),之后表达逐渐下降;在肝和肠中,72 h表达显著上升。p40c在脾、肝中,6 h表达显著上升;在肾中,48 h产生上调;在肠中,6 h开始上调,并在48 h上升至最高点。这表明了白细胞介素12的p35a亚基和p40c亚基响应了哈维氏弧菌感染半滑舌鳎的过程。ifn-γ在肝和肠中,均在p35a表达上调之前显著升高,在脾中晚于p35a上调表达;il-10在肝、脾、肾、肠中表达趋势中均与p40c的表达趋势相反。将半滑舌鳎淋巴细胞过表达p35a和p40c基因后,检测了受不同浓度脂多糖(LPS)刺激后干扰素(ifn-γ)、肿瘤坏死因子(tnf-α、tnf-β)等免疫相关细胞因子的表达变化。发现过表达半滑舌鳎的p35a、p40c基因能够显著提高tnf-α在LPS刺激下的表达水平。
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