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自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一类广泛、严重且伴随终生的神经发育障碍性疾病,其发病率逐年攀升,致病机制不清,无有效药物,给社会和家庭带来沉重负担。它的核心表现可总结为社会沟通与交往障碍、兴趣狭窄与重复刻板行为,还常伴有智力低下、胃肠问题、睡眠障碍、运动能力减弱等共患病。海马是脑内掌管学习与记忆的重要部位,海马区域的功能受损会导致认知障碍,而认知障碍会加重社交障碍,所以近年来ASD患者的海马功能受到广泛关注。ASD病因牵涉到遗传、环境、免疫和生化等多方面因素,但归根结底与神经发育障碍相关。目前已有的研究认为,ASD是在多基因遗传因素和发育早期的环境因素共同影响下,神经元的生长、修剪和凋亡过程以及突触发育过程出现异常所致。除了遗传这类先天性因素外,孕产期宫内环境对于神经系统发育尤其重要。临床研究发现,孕妇在使用了抗癫痫药丙戊酸钠（Sodium Valproate,VPA）之后,其后代患ASD的几率明显上升,这也在大量的实验动物研究中得到证实。颗粒蛋白前体（progranulin,PGRN）,是一种与伤口愈合、炎症、感染、肿瘤发生有关的生长因子,并以其在神经退行性疾病中的神经保护和增殖特性而著称。它最常见的功能是抗炎和促生长发育的作用。脑内PGRN主要由小胶质细胞和神经元产生,它不仅参与突触形成和突起的生长,还参与炎症的调控。当神经系统受到损伤时,PGRN一方面可以与TNF受体竞争性结合,拮抗NF-κB通路,减少炎症因子释放,另一方面还能通过促进神经元的生长和修复来减少神经元的凋亡,促进其存活。研究发现PGRN基因敲除小鼠在运动、学习记忆和社会行为中表现出障碍;PGRN在自闭症患者血清中呈现较低表达。本课题组在前期实验中观察了VPA大鼠不同脑区PGRN的表达情况,发现出生后35天、72天海马脑区的PGRN表达显著降低,神经元凋亡增强、数目减少。由此我们提出设想:VPA大鼠海马PGRN的持续低表达可能与自闭症样行为有关。那么过表达PGRN能否改善海马神经元的发育,从而减轻其自闭症样行为?如果可以,PGRN是通过什么机制进行调控的?临床研究报道,ASD患儿血清中TNF-α等炎症因子水平显著升高,ASD患者尸检报告发现小胶质细胞数量增加,出现阿米巴样激活态,这提示ASD患者脑中存在炎症反应。小胶质细胞是中枢神经系统常驻的免疫细胞,不断监视大脑微环境,对外部伤害保持高度敏感性。小胶质细胞不仅参与调控神经元生长、突触发育,还能分泌各种炎症因子维持内环境的稳态。在阿尔兹海默症、帕金森氏综合征等脑退行性疾病和多种原因所致的脑损伤中,常伴有过度激活的小胶质细胞吞噬神经元、突触,导致神经元丢失、突触减少等神经功能障碍的病理改变。研究还发现,PGRN敲除鼠在受到刺激时表现出与小胶质细胞过度激活相关的炎症反应。那么VPA大鼠海马中低表达的PGRN是否伴随小胶质细胞的激活和炎症反应?过表达PGRN是否能减少小胶质细胞的激活,下调炎症水平?因此本文在VPA大鼠建模基础上,首先观察了重组PGRN干预对其自闭症样行为的影响,随后探究了PGRN是否通过促进海马脑区神经元突触的生长发育或降低海马脑区炎症水平来改善VPA大鼠的自闭症样行为。其主要研究结果如下:第一部分PGRN改善VPA大鼠自闭症样行为目的:观察PGRN对VPA诱导的自闭症模型大鼠的自闭症样行为的作用。方法:1.VPA自闭症大鼠模型的制备和鉴定:（1）正常适龄SD大鼠雌雄合笼,见阴栓记为孕0天,在孕12.5天时VPA组按600mg/kg剂量腹腔注射VPA,对照组（CON组）予以等量生理盐水的注射,取其各自雄性子代作为实验对象。（2）出生后28-34天进行自闭症相关行为学检测:a.三腔室社交实验,反映大鼠的社交能力和社交偏好性。b.旷场实验,反映大鼠的空间探索能力、自主行为和焦虑程度。c.青年玩耍实验,反映大鼠的自主交流能力、攻击行为和探索能力。d.自我捋毛实验,反映大鼠的重复刻板行为。2.重组PGRN海马立体定位注射:（1）按上述方法建立VPA大鼠的模型,在VPA组雄性子代出生后10天时随机选取一部分进行海马立体定位注射重组PGRN。在第17天时再次进行注射。CON组和VPA组剩余大鼠同时进行双侧海马等量无菌生理盐水的假手术。（2）28-34天进行与前一步模型鉴定同样的行为学检测。结果:1.成功制备VPA自闭症模型:（1）三腔室社交实验结果显示,VPA大鼠的社交能力明显下降（P<0.05）,社交偏好明显出现缺陷（P<0.01）。（2）旷场实验结果显示,VPA大鼠自主行为和空间探索行为明显减少（P<0.05）,未出现明显焦虑行为（P>0.05）。（3）青年玩耍实验结果显示,VPA大鼠的自主交流能力明显下降（P<0.01）,攻击行为增加（P<0.05）,探索能力明显下降（P<0.01）。（4）自我捋毛实验结果显示,VPA大鼠存在明显重复刻板行为（P<0.01）。2.PGRN干预对VPA大鼠自闭症样行为的影响:（1）三腔室社交实验结果显示,PGRN明显增加VPA大鼠的社交能力（P<0.05）,改善VPA大鼠的社交偏好缺陷（P<0.05）。（2）旷场实验结果显示,PGRN明显增加VPA大鼠自主行为和空间探索行为（P<0.05）,但对焦虑行为无明显作用（P>0.05）。（3）青年玩耍实验结果显示,PGRN明显增加VPA大鼠自主交流时间（P<0.01）,对攻击行为（P>0.05）和探索能力（P>0.05）无明显作用。（4）自我捋毛实验显示,PGRN明显减少VPA大鼠的重复刻板行为（P<0.01）。结论:在孕12.5天经腹腔注射600mg/kg的VPA,可诱导SD大鼠的子代出现典型的自闭症样行为,VPA模型具有良好的可行性;在出生后10天、17天对VPA大鼠进行海马立体定位注射PGRN,有效地改善了VPA大鼠的社交能力、重复刻板行为。第二部分PGRN改善VPA大鼠自闭症样行为的机制探讨目的:1.体外实验探讨VPA是否能够通过NF-κB通路诱发小胶质细胞炎症反应。2.体内实验探讨PGRN是否能减少小胶质细胞的激活、改善NF-κB通路激活所致的炎症反应。3.体内实验探讨PGRN对于海马神经元突触发育的影响。方法:1.体外培养HAPI小胶质细胞系,用VPA处理24h。（1）显微镜下观察小胶质细胞的形态。（2）ELISA测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）的含量。（3）Western blot法检测小胶质细胞分泌TNF-α、白介素1β（interleukin1 beta,IL-1β）的情况和NF-κB通路关键蛋白核因子κB抑制物激酶β（inhibitor kappa B kinaseβ,IKKβ）、磷酸化的核因子κB抑制物激酶β（phosphorylated inhibitor kappa B kinaseβ,p-IKKβ）的表达情况。（4）免疫荧光法观察NF-κB通路p65蛋白核转位情况。2.体内实验观察PGRN对大鼠海马中小胶质细胞和NF-κB通路水平的影响:（1）Western blot法检测IL-1β、TNF-α的表达;NF-κB通路关键蛋白IKKβ、p-IKKβ、p65、磷酸化的p65（p-p65）蛋白的表达。（2）免疫荧光法检测三组大鼠海马组织中小胶质细胞特异性标记物钙离子适配器结合分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1）阳性细胞数量、p65蛋白核转位情况。3.体内实验观察PGRN对于海马神经元发育的影响:（1）高尔基染色法观察三组大鼠海马神经元树突棘总密度和成熟树突棘密度变化。（2）Western blot法检测三组大鼠海马组织中突触后致密蛋白95（Postsynaptic density protein95,PSD95）、突触体素（Synaptophysin,SYP）的表达。结果:1.体外培养HAPI小胶质细胞系,经VPA处理后:（1）显微镜下观察发现:VPA使小胶质细胞被激活成阿米巴样形态。（2）ELISA结果显示:VPA组HAPI细胞培养上清液中TNF-α（P<0.01）含量显著升高。（3）Western blot结果显示,与CON组相比,VPA组细胞p-IKKβ与IKKβ蛋白表达量的比值（P<0.05）显著增加,TNF-α（P<0.05）和IL-1β（P<0.05）蛋白表达量显著增加。（4）免疫荧光结果显示,CON组细胞中p65蛋白几乎全部分布于核周,VPA组细胞p65蛋白大量进入细胞核。2.三组大鼠海马中小胶质细胞数量和NF-κB通路水平:（1）免疫荧光结果显示:与CON组相比,VPA组海马中Iba-1标记阳性细胞数量显著增加（P<0.01）,p65蛋白从细胞质大量转移至核内;PGRN使VPA大鼠海马中Iba-1阳性细胞数量显著减少（P<0.01）,且使p65蛋白核转位现象得到抑制。（2）Western blot结果显示:a.与CON组相比,VPA组大鼠海马中IL-1β（P<0.01）和TNF-α（P<0.01）蛋白的表达显著增加;PGRN显著减少了VPA大鼠TNF-α（P<0.05）和IL-1β（P<0.05）蛋白的表达。b.与CON组相比,VPA组大鼠海马中p-IKKβ与IKKβ蛋白表达量的比值（P<0.05）和p-p65与p65蛋白表达量的比值（P<0.05）均显著增加;PGRN显著减少了VPA大鼠p-IKKβ与IKKβ蛋白表达量的比值（P<0.05）和p-p65与p65蛋白表达量的比值（P<0.05）。3.三组大鼠海马神经元发育情况:（1）高尔基染色结果显示:与CON组相比,VPA组大鼠的海马神经元树突棘总密度（P<0.05）和成熟树突棘密度（P<0.05）均显著减少;PGRN能使VPA大鼠海马神经元树突棘总密度（P<0.05）和成熟树突棘密度（P<0.05）均显著增加。（2）Western blot结果显示:与CON组相比,VPA组大鼠海马中突触发育相关蛋白PSD95（P<0.01）和SYP蛋白（P<0.05）表达显著降低;PGRN可显著增加VPA大鼠海马中PSD95（P<0.01）和SYP蛋白表达量（P<0.05）。结论:PGRN可能通过:1.抑制VPA大鼠海马中小胶质细胞的激活,下调NF-κB通路和炎症因子的水平,从而改善VPA大鼠的自闭症样行为。2.上调VPA大鼠的海马中突触发育相关蛋白PSD95和SYP的表达,改善海马神经元树突棘发育,从而改善VPA大鼠的自闭症样行为。