莲子心多糖的分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究

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莲子心(Plumula Nelumbinis)为睡莲科(Nymphaeaceae)莲属植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的成熟种子中间的绿色幼叶及胚根,莲子心味苦、归心、肾经是我国传统中药之一。莲子心具有多重的营养价值,莲子心多糖作为主要活性成分之一,具有较好的抗氧化、抗炎、降血糖以及调节糖脂代谢等功能。目前,对莲子心多糖的研究主要集中在莲子心粗多糖,缺乏对纯的莲子心多糖结构表征和生物活性的深入研究。有鉴于此,本文以莲子心为原料,考察了不同提取方法对莲子心粗多糖得率和特征结构的影响,然后对纯化得到分子量均一的莲子心多糖进行结构解析,对莲子心均一多糖的体外抗氧化活性、减轻氧化损伤和抗炎活性等生物活性进行评价。主要研究内容与结果如下:(1)比较了热水浸提、超声辅助提取、酶辅助提取和微波辅助提取四种提取方法对莲子心粗多糖理化性质、结构特征及功能特性的影响。结果表明,微波辅助提取法具有较高的得率,所得到的粗多糖有较高的糖纯度和糖醛酸含量。高效凝胶渗透色谱(HPGPC)结果表明,不同提取方法对莲子心多糖分子量的大小和分布均有影响,其中微波辅助提取法得到的莲子心多糖大分子量组分含量较高。微波辅助提取方法得到的莲子心粗多糖表面为多空粗糙特征,与其他三种方法得到的莲子心多糖有较大差异。流变性质测定表明,微波辅助提取法得到的莲子心多糖具有更好的流变特性。总之,微波辅助提取方法在莲子心多糖的提取中表现出较大的优势。(2)用响应面分析方法对微波辅助提取莲子心多糖的工艺进行了优化。结果表明:在微波时间4.5 min,微波功率为680 W,液料比为28 m L/g条件下,多糖得率为4.84±0.11%。对微波辅助提取得到的粗多糖进行Sevag法除蛋白处理、AB-8大孔树脂脱色处理以及DEAE-52柱层析和Sephadex G-200柱层析分离,最终得到分子量均一的莲子心多糖(PNP),其中糖纯度为88.48±1.58%,糖醛酸含量为22.74±0.87%。(3)经单糖组成、甲基化和NMR分析,结果表明,PNP由五种单糖组成,包括鼠李糖(18.41%)、半乳糖醛酸(18.24%)、木糖(16.92%)、半乳糖(14.26%)和阿拉伯糖(32.16%)。主要糖苷键的类型为→5)-α-L-Araf-(1→、→3)-α-D-Galp-(1→、α-D-Xylp-(→1、→3,4)-α-D-Rhap-(1→、→4)-α-D-Galp A-(1→。刚果红实验表明PNP没有三股螺旋结构。原子力显微镜结果表明,PNP呈现出大小不一、形状不规则的块状结构。(4)通过体外抗氧化实验和H2O2刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞建立的氧化应激模型,评价了PNP体外抗氧化活性以及对细胞氧化应激的保护作用。结果表明,PNP有良好的DPPH、ABTS和超氧自由基清除能力。在100-400μg/m L浓度范围内,PNP能够明显减少细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的产生,降低乳酸脱氢酶(LDH)的分泌,说明PNP能够保护氧化损伤的细胞膜。另外,PNP能够增强细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力,以及能够显著增加谷胱甘肽(GSH)含量和总抗氧化能力(T-AOC)水平,说明PNP样品能够通过增强细胞内酶促抗氧化防御系统的活力和非酶促抗氧化系统的水平来保护细胞,免受氧化带来的损伤。(5)通过LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞建立的炎症模型,研究了PNP的抗炎活性。在100-1200μg/m L浓度范围内,PNP都不会对LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞产生毒性影响。并且能够明显抑制LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞中NO、TNF-α、INF-γ、IL-1β和IL-6等的表达(p<0.05),并随着样品浓度的增加抑制作用增强。PNP能够减少MAPK细胞通路中ERK、JNK、p38的磷酸化,同时减少NF-κB细胞通路中p65和IκB-α的磷酸化以及c-Jun的含量,增加细胞内IκB-α的水平。说明PNP能够通过影响细胞中MAPK/NF-κB/AP-1信号通路发挥抗炎活性。
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