论文部分内容阅读
目的为了研究RACK1及其突变体与氯离子通道蛋白CLIC1的相互作用,运用分子克隆技术构建带FLAG标签的RACK1突变体的真核表达质粒,原核表达质粒和CLIC1的原核表达质粒,通过酵母双杂交,瞬时转染,免疫荧光,免疫共沉淀和GST-pulldown等实验研究在体内外实验中蛋白质的共定位及相互作用。方法以pc DNA3.1-RACK1重组质粒为模板,运用分子克隆技术构建重组酵母质粒p GBKT7/p GADT7-RACK1,p GBKT7/p GADT7-RACK1-N(1-138),p GBKT7/p GADT7-RACK1-C(130-317),分别与实验室保存的CLIC1的酵母表达质粒,共同转化到酵母细胞(ΑH109)中,并在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培养基上进行营养筛选,对长出的克隆进行半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性测定,通过观察克隆变蓝情况来验证RACK1及其突变体是否与CLIC1存在相互作用;构建真核表达质粒pc DNA3.1-RACK1-N(1-138)-FLAG、pc DNA3.1-RACK1-C(130-317)-FLAG及原核表达质粒p GEX-5X-3-RACK1-N(1-138)、p GEX-5X-3-RACK1-C(130-317)、p GEX-5X-3-CLIC1;用激光共聚焦荧光显微镜观察蛋白在COS7细胞内的定位情况;将RACK1全长及其缺失突变体转染入HEK 293T或COS7细胞中,分别提取胞质蛋白与核蛋白,利用Western blot法检测蛋白在胞质与胞核中表达情况,进一步说明蛋白质在细胞内的定位情况;并与p CDGFP-CLIC1共转染到HEK 293T或COS7细胞中,通过免疫共沉淀技术检测RACK1及其突变体蛋白与CLIC1蛋白在体内是否相互作用;从转染了相关质粒的BL21感受态细胞中纯化GST-CLIC1,GST-RACK1,GST-RACK1-N和GST-RACK1-C融合蛋白,然后进行GST-pulldown实验,检测蛋白在体外相互作用情况。结果酶切鉴定和测序结果表明成功构建了实验相关的重组质粒。酵母双杂交实验显示,共同表达了CLIC1和RACK1或突变体(RACK1-N)这两种蛋白的酵母细胞在SD3-培养基中能够正常生长,且克隆在进行α-半乳糖苷酶活性测定后大多数颜色变蓝,即证明二者可能存在相互作用。分离胞质蛋白与核蛋白,Western blot结果表明在胞质与胞核中均有表达,以细胞质为主,共聚焦荧光显微镜观察到野生型RACK1蛋白和突变体蛋白主要分布在细胞质与核膜处,细胞核中也有一定量的分布,与在细胞质细胞核均有分布的CLIC1蛋白有共定位现象存在。免疫共沉淀实验表明野生型RACK1蛋白及突变体蛋白都和CLIC1蛋白存在相互作用。在最佳条件下成功诱导表达GST-CLIC1蛋白、GST-RACK1蛋白、GST-RACK1-N蛋白、GST-RACK1-C蛋白,GST-pulldown实验表明野生型RACK1蛋白及突变体蛋白都可以和CLIC1蛋白相互作用。结论酵母双杂交实验表明野生型RACK1及其突变体蛋白与CLIC1蛋白可能存在相互作用,免疫荧光实验,免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验进一步证实它们之间的相互作用。