【摘 要】
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目的:探讨负载人肝癌相关抗原衰老标记蛋白-30（Senescence marker protein-30,SMP30）和热休克蛋白70样蛋白1（Heat shock proteins 70 like 1,HSP70L1）的树突状细胞（Dendritic cell,DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）在荷人肝癌裸鼠体内抗肝癌效应。方法:（1）通过Fic
【基金项目】
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广西自然科学基金,项目名称:Kinectin-HSP70融合基因修饰DC诱生CTL抗肝癌作用研究,项目合同编号:2017GXNSFAA198079,项目起止时间:2017-07-01至2020-06-30
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目的:探讨负载人肝癌相关抗原衰老标记蛋白-30（Senescence marker protein-30,SMP30）和热休克蛋白70样蛋白1（Heat shock proteins 70 like 1,HSP70L1）的树突状细胞（Dendritic cell,DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）在荷人肝癌裸鼠体内抗肝癌效应。方法:（1）通过Ficoll密度梯度离心法从HLA-A2+健康成人外周血分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,重组人GM-CSF、IL-4和TNF-ɑ诱导生成DC;利用基因重组技术将SMP30、HSP70L1基因连接到慢病毒载体上,构建SMP30、HSP70L1双基因（SMP30-HSP70L1）重组慢病毒、SMP30重组慢病毒和HSP70L1重组慢病毒并分别用其转染上述DC,空载慢病毒转染DC、肝癌组织总蛋白致敏DC作为对照。用Western blot检测各组SMP30蛋白和HSP70L1蛋白的表达情况。（2）用人CD3免疫磁珠分选同DC个体来源的T淋巴细胞,将CD3+T淋巴细胞与上述刺激后的DC共培养诱导生成CTL。（3）体外培养人肝癌细胞系SMMC-7721至对数生长期,接种于裸鼠右侧腋窝中后部建立BALB/c裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,将荷人肝癌裸鼠随机分成7组,每组6只:SMP30-HSP70L1组、肝癌组织总蛋白组、SMP30组、HSP70L1组、慢病毒空载组、空白DC组和PBS组。（4）在荷瘤裸鼠皮下移植瘤种植后的第12天开始输注第1次CTL,之后每4天给荷瘤裸鼠输注CTL（即在输注第1次CTL后的第5、9、13、17天）,总共输注5次,期间每3天用游标卡尺测量皮下移植瘤的长短径、电子天平称量荷瘤裸鼠体重,绘制移植瘤生长曲线和体重变化曲线。（5）在末次CTL治疗后的第2天采用颈椎脱臼法处死荷瘤裸鼠,剥离瘤体称重,计算各组肿瘤抑制率,采用苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察各组皮下移植瘤和肝、肾脏形态。（6）用ELISA检测各组荷瘤裸鼠血清中IFN-γ和TNF-ɑ的浓度。结果:（1）重组慢病毒转染和肝癌组织总蛋白致敏DC后,SMP30-HSP70L1组和SMP30组的SMP30蛋白相对表达水平高于肝癌组织总蛋白组、HSP70L1组、慢病毒空载组以及空白DC组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;肝癌组织总蛋白组和SMP30-HSP70L1组的相对HSP70L1蛋白表达水平高于SMP30组、慢病毒空载组和空白DC组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;HSP70L1组的相对HSP70L1蛋白表达水平高于慢病毒空载组和空白DC组,差异存在统计学意义（P0.05）。（4）经HE染色后,可见各组肿瘤细胞呈弥漫分布,排列紧密,间质稀少,细胞异形性明显,PBS组、空白DC组和慢病毒空载组的组织中有较多血管生成,SMP30-HSP70L1组和肝癌组织总蛋白组的组织中血管较少。（5）SMP30-HSP70L1组裸鼠血清中IFN-γ的浓度（531.22±2.39 pg/m L）均高于肝癌组织总蛋白组、SMP30组、HSP70L1组、慢病毒空载组、空白DC组和PBS组,差异有统计学意义（P<0.05）。SMP30-HSP70L1组裸鼠血清中TNF-ɑ的浓度（121.16±10.07pg/m L）在各组中是最高的,与肝癌组织总蛋白组、慢病毒空载组、空白DC组和PBS组相比存在统计学差异（P0.05）。（6）各组裸鼠的体重均未出现明显下降,裸鼠肝、肾脏HE染色显示其细胞形态较为完整、胞核无增大,未出现损伤性的病理反应。结论:人肝癌相关抗原SMP30和HSP70L1联合转染DC诱导的CTL对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长有一定地抑制作用,且能改变荷瘤裸鼠体内一些相关抗肿瘤细胞因子的变化,对治疗裸鼠的副作用小。
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