视网膜母细胞瘤(Rb)是小儿最常见的眼内恶性肿瘤，随着早期诊断、早期治疗及治疗方法的不断改进，其生存率目前在美国达95％，在世界范围约为50％。手术摘除眼球虽然较为安全，但创伤较大，降低了患者的生存质量。外放射是一种有效的治疗方法，但因其可产生严重的并发症，现在已不作为首选治疗。药物治疗始终是一个焦点，在发达国家化学减容疗法治疗眼内期视网膜母细胞瘤取得显著成绩，对有复发和转移高危因素的患者术后辅助化疗提高了患者的生存率，对颅内蔓延和远处转移患者的治疗不断改进。但传统化疗仍存在很多不足，如药物对正常组织细胞的杀伤；反复用药后产生耐药性等。因此在寻找新药的同时，还要寻找药物治疗的新途径。 肿瘤分化治疗与传统化疗不同，它是通过分化剂的诱导使畸形分化的肿瘤细胞向正常表型细胞的终末方向分化，抑制其增殖，分化治疗在白血病的治疗中已显示出巨大潜力。实验数据表明，分化剂可同样抑制实体肿瘤细胞的增殖并促使其向正常细胞转化。Rb起源于视网膜多能干细胞，在分化剂的诱导下可向多个正常细胞表型分化。但细胞的分化受多种因素调控，Hedgehog信号通路是在动物胚胎发育过程中起重要作用的信号通路之一，尤其在视网膜细胞分化中起重要作用。已证实多种肿瘤的发生与Hedgehog信号通路的异常有密切关系，该通路的抑制剂cyclopamine对某些肿瘤的生长产生明显的抑制作用甚至使肿瘤消失。因此本研究拟探讨视网膜母细胞瘤的诱导分化及Hedgehog信号通路各成份的表达，为进一步研究视网膜母细胞瘤的靶向治疗打下基础。 第一部分药物治疗视网膜母细胞瘤的临床病例分析 目的：探讨化疗对患者生存及预后的影响及观察化学减容疗法对眼内期视网膜母细胞瘤的疗效。 方法：收集1997～2004年于中山眼科中心诊治的268例Rb患者资料，随访了135例，其中男80例，女55例；单眼107例，双眼28例。分析这些患者的一般状况、治疗情况及其对生存的影响、肿瘤的病理侵袭范围及其对生存的影响、生存与死亡情况。 对行化学减容治疗眼内期Rb的14例患者15只眼进行随访观察，其中男8例，女6例；单侧1例，双侧13例。分析患者的一般状况、肿瘤特征、治疗前后肿瘤的变化、预后情况。 用SPSS13.0软件包进行统计学分析。结果：Rb患者1、2、3、4、5年的生存率分别为84％、83％、83％、81％、81％。眼外期患者中化疗组生存率明显高于未经化疗组，两者间有统计学差异(P=0.000)。视神经、脉络膜、巩膜、前房是否受累的生存率间分别有统计学差异(P值均＜0.05)，但视神经合并脉络膜受累并没有进一步降低视神经受累的生存率(P=0.181)。视神经、脉络膜、巩膜、前房受累、化疗及植入义眼座对死亡风险的危险比分别为4.881，1.147，3.007，1.550，0.051，0.136。 化学减容前眼内肿瘤基底最大直径平均为10.27mm(5.61～18.8mm)，最大厚度平均为6.29mm(1.77～11.28mm)；治疗结束后分别为4.77mm(1.5～7.25mm)、2.47mm(1.41～5mm，2例厚度不祥)，比化疗前分别减少了53.6％(-0.2％～60.1％)、50.6％(28.6％～83.2％)。化学减容疗法总有效率为46.7％，无效率为53.3％，眼球保留率为40％。多数患者可耐受化疗，无严重并发症发生。 结论：影响患者预后的病理高危因素依次为视神经、巩膜、前房、脉络膜受累。术后辅助化疗提高了有复发和转移高危因素的视网膜母细胞瘤患者的生存和预后。化学减容疗法对眼内期视网膜母细胞瘤有一定疗效，是一种有潜力的保守治疗方法。 第二部分视网膜母细胞瘤的体外分化研究 目的：观察全反式维甲酸(ATRA)对视网膜母细胞瘤S0—Rb50细胞生长的抑制作用及S0—Rb50细胞向正常细胞表型分化的情况。 方法：用0、10-7、10-6、10-5M的ATRA作用于S0—Rb50细胞，绘制生长曲线；MTT法检测ATRA的IC50值；10-5M的ATRA作用于细胞，用流式细胞仪测定用药前及用药后1、2、3、7天的细胞周期；观察用药前及用药后20天活体细胞和HE染色细胞形态；免疫组化法检测用药前及用药后20天NSE、Vimentin、GFAP的表达情况。 结果：0、10-7、10-6、10-5M的ATRA作用于SO—Rb50细胞后细胞生长曲线逐渐变得低平；ATRA作用于细胞的IC50值约为10-5M；用10-5M的ATRA作用后，GO/G1期细胞从用药前的56.5％升至用药后的66.6％～81.0％，S期细胞则从33.1％降至22.3％～15.9％，用药后48小时作用达高峰。细胞在包被0.25％多聚赖氨酸溶液的载玻片上可贴壁生长，用药后细胞生长集落明显减小，20天后部分细胞呈椭圆形或梭形，核浆比值减小，并伸出细长或较短的突起；用药前NSE染色中等阳性，Vimentin染色强阳性，GFAP染色阴性；用药20天后NSE与Vimentin染色呈强阳性，GFAP染色呈中等阳性。 结论：ATRA对S0—Rb50细胞的生长有明显抑制作用，使细胞停滞于细胞周期的GO/G1期。ATRA对Eb细胞有诱导分化作用并促使细胞向神经元和胶质细胞方向分化。 第三部分视网膜母细胞瘤中Hedgehog通路相关信号因子的表达 目的：探讨SHH信号因子在Rb发生发展过程中的作用，寻找治疗Rb的更特异性的靶向治疗途径。 方法：选取2004年4月～2004年8月因视网膜母细胞瘤于我院行患眼摘除的17例患儿中的8例含较多活性肿瘤组织的标本。男性5例，女性3例；双眼1例，单眼7例。用RT一PCR方法检测Hedgehog信号通路相关因子SHH、PTC、SMO、GLI1蛋白基因在Rb细胞中的表达情况。 结果：8份标本中4份表达SHH，3份表达PTC，5份表达SMO，4份表达GLI1。表达产物分别为233bp、144bp、140bp、412bp。阳性标本外观上均呈灰白色半透明胶状，几乎无钙化灶。病理上7例为眼内期，1例为眼外期。 结论：SHH信号通路的异常活化可能参与了Rb的发生，在抑制Rb细胞分化、维持Eb细胞活性、促进Rb发展中有一定的作用。抑制SHH信号通路的异常活化可能是Rb的一个靶向治疗途径。