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目的通过建立体内支气哮喘大鼠气道炎症损伤模型,及体外脂多糖（LPS）诱导人气道上皮细胞（16HBE）炎症损伤模型,基于ROS/HMGB1/Beclin-1通路从细胞自噬角度研究平喘宁（PCN）对支气管哮喘气道炎症的保护作用及其分子机制,为哮喘及其并发症的防治提供实验依据与新思路。方法第一部分细胞自噬在平喘宁缓解支气管哮喘大鼠模型气道炎症中的作用105只SPF级SD大鼠,每组15只,正常组用生理盐水替代,其余大鼠致敏造模。实验第29天给药开始对各组大鼠进行灌胃给药,平喘宁高、中、低剂量组分别按14.578、7.289、3.645g·kg-1给药,地塞米松组按0.405mg·kg-1给药,桂龙咳喘宁组按0.405g·kg-1给药,正常组和模型组分别给予等量的生理盐水。观察各组大鼠一般情况,包括体质量、摄水量、摄食量。支气管肺泡灌洗液（BALF）检测炎性细胞总数,动物肺功能仪检测大鼠肺功能。透射电镜（TEM）观察大鼠肺组织自噬水平;流式细胞术检测肺组织ROS水平,生化检测血清MDA、SOD水平。免疫荧光（IF）检测大鼠肺组织HMGB1、Beclin-1、ATG5的表达;蛋白免疫印迹法（WB）检测HMGB1、Beclin-1、Bcl-2、ATG5、LC3蛋白表达量;RT-q PCR检测HMGB1、Beclin-1、Bcl-2、ATG5m RNA表达量。ELISA检测大鼠血清IFN-r、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-13、TNF-α细胞因子水平。第二部分细胞自噬在平喘宁缓解16HBE炎症模型损伤中的作用1.建立LPS体外诱导16HBE炎症损伤模型体外培养16HBE细胞株,分为:正常培养基不含细胞组、正常培养基加细胞组、200ng/ml LPS组、400ng/ml LPS组、800ngml LPS组、1000ng/ml LPS组、1200ng/ml LPS组、1600ng/ml LPS组、2000ng/ml LPS组。各组分别培养时间6H、12H、24H、36H,光学倒置显微镜观察细胞形态学;CCK8法检测细胞存活率。2.PCN对LPS诱导人气道上皮细胞炎症损伤模型保护作用机制研究将细胞分为正常培养基不含细胞组;正常培养基加细胞组、5%PCN含药血清加LPS组、10%PCN含药血清加LPS组;15%PCN含药血清加LPS组、20%PCN含药血清加LPS组。采用光学倒置显微镜观察细胞形态学,CCK8法检测细胞存活率。而后进行第二部分实验,分为五组:正常组、LPS组、3-MA组、RAPA组、PCN组。对各组细胞进行处理后检测如下:流式细胞仪检测ROS释放量,应用TEM观察各组细胞的超微结构,IF检测细胞中Beclin-1、Bcl-2、ATG5蛋白表达,WB方法检测细胞中Beclin-1、Bcl-2、LC3和ATG5蛋白表达,ELISA检测细胞中炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α水平。第三部分PCN通过ROS/HMGB1/Beclin-1通路缓解16HBE哮喘炎症模型损伤将16HBE细胞分为正常组、LPS组、Glycyrrhizin组、PCN组。细胞进行处理检测方法如下:流式细胞仪检测ROS释放量,应用TEM观察各组细胞的超微结构,IF法检测细胞中HMGB1、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达,WB法检测细胞中HMGB1、Beclin-1、Bcl-2、LC3和ATG5蛋白表达。结果第一部分细胞自噬在PCN缓解支气管哮喘大鼠模型气道炎症中的作用1.哮喘模型大鼠一般情况变化及PCN对其影响体质量:造模0d,各组大鼠体质量无差异（P>0.05）,造模21d,与正常组相比,各造模组体质量明显显著下降（P<0.01）;造模第35d,各造模组大鼠体质量较对照组大鼠体质量相比呈下降趋势（P<0.01）;至实验结束即第49d,与正常组相比,其余各组大鼠体质量明显显著降低（P<0.01）;与模型组相比,其余各治疗组大鼠体质量大鼠体质量增多（P<0.01）。进食量:造模0d,各组大鼠进食量无统计学差异（P>0.05）;造模21d,各组大鼠进食量无明显差异（P>0.05）;造模第35d,各造模组大鼠进食量较对照组大鼠进食量呈下降趋势（P<0.01）;至实验结束即第49d,与正常组相比,其余各组大鼠进食量均减少（P<0.01）,其中平喘宁高剂量组与正常组相比减少（P<0.05）;与模型组相比,各治疗组大鼠进食量均有所增加（P<0.01）。进水量:造模0d,各组大鼠进水量无差异（P>0.05）;造模21d,各组大鼠进水量无明显差异（P>0.05）;造模第35d,各造模组大鼠进水量较对照组大鼠进水量均减少（P<0.01）;至实验结束即第49d,与正常组相比,各组大鼠进水量均减少（P<0.01）;与模型组相比,各治疗组大鼠进水量均增加（P<0.01）。2.哮喘模型大鼠肺功能变化及PCN对其影响与正常组相比,模型组大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC均有差异（P<0.01）;与模型组相比,各治疗组FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC均有差异（P<0.01）。3.哮喘模型大鼠BALF炎性细胞数的变化及PCN对其影响与正常组相比,模型组大鼠BALF中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、白细胞数量差异均有统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,平喘宁低中高剂量组、地塞米松组,桂龙咳喘宁组大鼠BALF中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、白细胞数量均有统计学差异（P<0.01）。4.哮喘模型大鼠肺组织ROS、血清MDA和SOD变化及PCN对其影响与正常组相比,模型组ROS、MDA及SOD值均有差异（P<0.01）;与模型组相比,各治疗组ROS、MDA及SOD值均有差异（P<0.01）。5.TEM观察哮喘模型大鼠肺组织超微变化及PCN对其影响采用透射电镜TEM观察各组大鼠肺组织细胞自噬水平,观察发现各组均可见自噬小泡,模型组大鼠有较多自噬小泡,而正常组细胞和其他各治疗组电镜图观察到自噬泡远不如模型组多,除此之外,嗜锇性板层小体排空明显,线粒体嵴排列紊乱及水肿,而治疗组的Ⅱ型细胞板层小体排空及线粒体变化较轻。6.IF法检测哮喘模型大鼠肺组织HMGB1、Beclin-1、ATG5蛋白表达量及PCN对其影响与正常相比,模型组Beclin-1、HMGB1、ATG5免疫荧光密度值均升高（P<0.01）。与模型组相比,平喘宁低剂量组HMGB1免疫荧光密度值比无差异,其余各组均有差异（P<0.01）。7.WB法检测哮喘模型大鼠肺组织HMGB1、Beclin-1、Bcl-2、ATG5、LC3蛋白表达量及PCN对其影响与正常组相比,模型组Beclin-1、HMGB1、ATG5、Bcl-2蛋白表达及LC3II/LC3I比值均有统计学差异（P<0.01或P<0.05）;与模型组相比,各组大鼠干预后Beclin-1、HMGB1、ATG5蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调及LC3II/LC3I比值下调（P<0.01或P<0.05）。8.RT-q PCR法检测哮喘模型大鼠肺组织HMGB1、Beclin-1、Bcl-2、ATG5m RNA表达量及PCN对其影响与正常组相比,模型组HMGB1、Beclin-1、ATG5、Bcl-2m RNA均有差异（P<0.05）;与模型组相比,平喘宁低、中剂量组Beclin-1m RNA无统计学差异,其余各治疗组与模型组相比均有统计学差异（P<0.01或P<0.05）。9.ELISA法检测哮喘模型大鼠肺组织IFN-r、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-13、TNF-α细胞因子水平变化及PCN对其影响与正常组比,模型组IFN-r、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-13、TNF-α均有统计学差异（P<0.05）。与模型组相比,各治疗组IFN-r、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-13、TNF-α均有差异（P<0.01）。第二部分细胞自噬在PCN缓解16HBE炎症模型损伤中的作用1.体外LPS诱导人支气管气道上皮细胞炎症模型的建立本实验采用经典的哮喘气道炎症体外模型LPS损伤16HBE细胞筛选造模浓度。随着LPS作用剂量的增加以及作用时间的延长,1200ng/ml LPS作用12H后,细胞存活率为45.9±6.0%,接近IC50,因此选择1200ng/ml LPS和12H作为16HBE细胞最佳造模浓度与时间。2.PCN对16HBE干预后ROS的变化与正常组相比,模型组ROS水升高（P<0.01或P<0.05）,与模型组相比,各治疗组ROS水平均下降（P<0.01）。3.PCN对16HBE干预后细胞的超微结构的变化正常组细胞结构及形态基本正常,细胞核染色质丰富且分布均匀;内质网、线粒体及峭较完整;经过LPS造模的细胞内可见自噬的标志性结构-自噬泡,RAPA组自噬泡增多,少量线粒体出现峭溶解断裂;经过3-MA、PCN组干预后其形态和超微结构均改善,细胞形态良好,可见到自噬小泡和及峭较完整的线粒体。4.WB法检测PCN对16HBE干预后其Beclin-1、Bcl-2、LC3、ATG5蛋白表达变化与正常组相比,模型组Beclin-1、ATG5蛋白表达、LC3II/LC3I比值升高（P<0.01或P<0.05）,Bcl-2蛋白表达降低（P<0.01）;与模型组相比,3-MA组、RAPA组和PCN组Beclin-1、ATG5蛋白表达、LC3II/LC3I比值降低（P<0.01或P<0.05）,Bcl-2蛋白表达升高（P<0.01）。5.IF检测PCN对16HBE干预后其Beclin-1、Bcl-2、ATG5蛋白表达的变化与正常组相比,模型组ATG5、Beclin-1蛋白表达升高（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达降低（P<0.01）;与模型组比,RAPA组,3-MA组和PCN组ATG5蛋白表达降低、Bcl-2蛋白表达升高、Beclin-1蛋白表达降低（P<0.01）。6.PCN对16HBE干预后炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平的变化与正常组相比,模型组IL-6、IL-8、TNF-α炎症因子水平均升高（P<0.01或P<0.05）。与模型组相比,3-MA组、PCN组IL-6、IL-8、TNF-α炎症因子水平和RAPA组IL-6水平均下降（P<0.01或P<0.05）,RAPA组IL-8、TNF-α与模型组相比无差异（P>0.05）。第三部分PCN通过ROS/HMGB1/Beclin-1通路缓解16HBE哮喘炎症模型损伤1.PCN对16HBE干预后ROS的变化与正常组相比,模型组ROS水平升高（P<0.01）;与模型组相比,GLY组与PCN组ROS水平均下降（P<0.01）。2.PCN对16HBE干预后细胞的超微结构的变化正常组中细胞基本结构及形态完好,细胞核染色质丰富、分布均匀;内可见内质网及线粒体;经过LPS造模的模型组细胞内可见自噬的标志性结构-自噬泡,GLY组、PCN组干预后其形态和超微结构均改善,细胞基本形态较好,可见到自噬泡和线粒体,其中线粒体峭较完整。3.WB法检测PCN对16HBE干预后细胞Beclin-1、Bcl-2、LC3,ATG5蛋白表达的变化与正常组比,模型组HMGB1、Beclin-1、ATG5蛋白表达升高（P<0.01或P<0.05）、Bcl-2蛋白表达降低（P<0.01）、LC3II/LC3I比值升高（P<0.01）;与模型组比,GLY组和PCN组HMGB1、Beclin-1、ATG5蛋白表达降低（P<0.01或P<0.05）、Bcl-2蛋白表达升高（P<0.01）、LC3II/LC3I比值降低（P<0.01或P<0.05）。4.免疫荧光法检测PCN对16HBE干预后细胞Beclin-1、Bcl-2、ATG5蛋白表达的变化与正常组比,模型组HMGB1、Beclin-1蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低（P<0.01）;与模型组相比,GLY组、PCN组HMGB1、Beclin-1蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高（P<0.01或P<0.05）。结论1平喘宁可以缓解大鼠气道炎症,改善肺功能。其机制可能与减轻氧化应激水平,减少ROS的过度累积,抑制HMGB1与Beclin-1的结合,达到抑制细胞自噬从而缓解炎症损伤有关。2平喘宁对LPS诱导的16HBE炎症损伤具有保护作用,其机制可能是通过抑制ROS/HMGB1/Beclin-1的过度表达抑制自噬,降低炎症反应有关。