miR-370-3P通过调节JAK2/STAT5B轴对人关节软骨细胞增殖的影响

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目的:研究非编码单链RNA(micro RNA,miRNA)miR-370-3P是否通过调控JAK2(Janus kinase2,Janus激酶2)/STAT5B(signal transducer and activator of transcription 5B,信号传导和转录激活因子5B)信号通路进而调节人关节软骨细胞(Human Chondrocytes-articular,HC-a)的增殖过程,并探讨其潜在作用机制。方法:(1)通过脂质体转染实验构建miR-370-3p过表达/低表达HC-a软骨细胞模型,将细胞分为5组:miR-370-3p mimic模拟物组(miR-370-3p过表达组)、miR-370-3p inhibitor遏制物组(miR-370-3p低表达组)、mNC(mimic normol control,mimic空载体对照组)、iNC(inhibitor normol control,inhibitor空载体对照组)、normol正常对照组,通过miRNA实时荧光定量PCR检测各组miR-370-3p的相对表达量。(2)qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase Chain Reaction)检测各组JAK2、STAT5B mRNA的相对表达量。(3)Western blot实验检测JAK2、STAT5B蛋白在各组中的表达水平。(4)MTT比色实验法检测各组HC-a细胞的相对增殖情况。(5)通过双荧光素酶实验检测miR-370-3p与JAK2、STAT5B的结合情况。结果:miRNA实时荧光定量PCR结果提示与正常对照组对比,mimic组miR-370-3p表达量呈上调趋势(P<0.05),inhibitor组miR-370-3p表达为下调(P<0.05),表明miR-370-3p过表达/低表达HC-a软骨细胞模型构建成功;qRT-PCR结果提示相比较于正常对照组,JAK2和STAT5B在mimic组的mRNA相对表达量下调,在inhibitor组上调。(P<0.05),而且空载体对照组和正常对照组之间相比,三组之间的差异没有统计学意义。Western blot实验显示JAK2和STAT5B蛋白在mimic组也有显著下调,在inhibitor组的蛋白表达量增加。MTT实验提示miR-370-3p的过表达会降低HC-a的存活率(P<0.05),提示miR-370-3p的过表达会抑制人关节软骨细胞(HC-a)的增殖。双荧光素酶实验结果显示,miR-370-3p和JAK2-WT(野生型)、STAT5B-WT(野生型)质粒共转染后,荧光表达情况相比于对照组有显著下调,提示miR-370-3p可直接与JAK2-3’UTR、STAT5B-3’UTR直接结合发挥作用。结论:miR-370-3p可通过直接靶向作用于JAK2/STAT5B信号通路进而抑制人关节软骨细胞(HC-a)的增殖。
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