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目的:糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见而严重的微血管并发症之一,大约20%-30%的糖尿病患者发生DN,其中一部分进展为终末期肾病,给社会带来沉重的经济负担。有研究发现高糖可以减少系膜细胞间隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)的表达,降低细胞间通讯,使系膜细胞肥大、增殖、细胞外基质成分增多,破坏肾小球滤过屏障,参与DN早期高滤过;高糖也可以促进系膜细胞分泌纤维连接蛋白(FN),参与肾小球纤维化,但其中的机制不明。近年来,泛素蛋白酶体通路(UPP)受到关注,它的降解蛋白质紊乱引起地细胞稳态的失衡可能与一些疾病的发生有关。而已知与DN发病机制有关的一些蛋白也是经由UPP降解的,故为了明确UPP是否参与了高糖对Cx43、FN的影响,本实验观察了高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞Cx43和FN的蛋白表达,并用蛋白酶体抑制剂MG132作为干预因素,初步探讨了高糖对系膜细胞间Cx43和分泌FN的影响以及UPP在其中的作用,为DN的防治寻找新的依据。
方法:
1、将培养的大鼠HBZY-1肾小球系膜细胞分为7组,分别为:
①正常对照组(5.6mmol/L 葡萄糖);
②高糖甲组(10mmol/L 葡萄糖);
③高糖乙组(20mmol/L 葡萄糖);
④高糖丙组(30mmol/L 葡萄糖);
⑤高糖丙组(30mmol/L 葡萄糖)+MG132组;
⑥甘露醇组(24.4mmol/L 甘露醇作为渗透压对照);
⑦高糖丙组(30mmol/L葡萄糖)+二甲亚砜。
2、Cx43测定:把系膜细胞按2×104个/孔接种在6孔板中培养,各组分别作用系膜细胞48小时。其中第⑥组和第⑦组MG132和DMSO的终浓度均为20 μmol/L。用细胞免疫荧光染色、激光扫描共聚焦显微镜观察各组细胞间Cx43的蛋白表达。
3、培养上清液FN的测定:系膜细胞按1×104个/孔接种在24孔板中培养,各组分别作用系膜细胞24小时。其中第⑥组和第⑦组MG132和DMSO的终浓度均为1 μmol/L)。用ELISA试剂盒测培养细胞上清液中FN的含量。
结果:
1、正常对照组,Cx43表达丰富;不同浓度的葡萄糖刺激系膜细胞48小时后,Cx43蛋白表达较正常对照组显著降低(P<0.05),且随着葡萄糖浓度的增加,对Cx43抑制作用越明显;30mmol/L葡萄糖较正常组Cx43蛋白减少了85.3%(P<0.05);MG132组Cx43蛋白较高糖丙组升高了5倍(P<0.05);甘露醇对Cx43蛋白表达无影响(P>0.05);二甲亚砜溶剂不影响高糖对Cx43的作用。
2、不同浓度的葡萄糖刺激系膜细胞24小时后, FN的蛋白含量较正常组升高(P<0.05),且随浓度的增加,分泌FN亦增加;30mmol/L葡萄糖组较正常组FN含量升高了1倍(P<0.05);MG132组FN含量较高糖组减少了31.3%(P<0.05),但较正常组仍升高了39.3%(P>0.05);甘露醇对FN蛋白无影响(P>0.05);二甲亚砜溶剂不影响高糖对FN的作用。
结论:
1、高糖可呈浓度依赖性地抑制系膜细胞之间Cx43的蛋白表达,且不依赖渗透压;泛素蛋白酶体途径参与了高糖所致Cx43蛋白的表达下调。
2、高糖可呈浓度依赖性地促进肾小球系膜细胞分泌FN;泛素蛋白酶体途径参与了高糖促进系膜细胞FN分泌地发生。