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目的:探讨清心开窍方通过MAPK通路对APP/PS1双转基因小鼠认知功能及神经元凋亡的影响
方法:选用80只SPF级雄性APP/PS1双转基因小鼠(25±3g),用随机数字表法随机分为5组,即模型组,高剂量组,中剂量组和低剂量组,每组20只.另选取20只同背景雄性C57BL/6J小鼠为对照组.所有小鼠于本校SPF级动物房饲养,适应环境7天后进行灌胃,高剂量组,中剂量组,低剂量组分别服用19g/kg/d,9.5g/kg/d及4.75g/kg/d的清心开窍方水煎剂,对照组,模型组分别灌服等体积的生理盐水.连续灌胃90天.治疗完成后,采用Morris水迷宫测试小鼠的空间学习记忆能力.Morris水迷宫包括定位航行实验(逃避潜伏期)和空间搜索实验(穿台次数).Morris水迷宫测试结束后,将各组小鼠经心脏依次灌注生理盐水及4%多聚甲醛固定,用免疫组织化学法观察Aβ在小鼠海马CA1区神经元中的表达,用HE染色法、尼氏染色法和透射式电子显微镜观察小鼠海马CA1区神经元超微结构及其形态学的改变,用Tunel染色法检测海马区神经元细胞的凋亡情况,采用WesternBlot法检测海马区Bax、Bcl-2、caspase-3、p-ERK1/2、ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK及p-p38MAPK的蛋白表达,ELISA法测试cleavedcaspase-3的表达.
结果:
1.Morris水迷宫结果
在4天的定位航行试验训练里,各组小鼠的逃避潜伏期时间随着时间推移呈下降趋势,训练至第3天各组小鼠逃避潜伏期开始趋于平稳.第1天和第2天各组小鼠逃避潜伏期比较无明显差异(P>0.05);训练第3天,模型组小鼠与对照组比较逃避潜伏期逐渐延长,且有统计学差异(P<0.05),中剂量清心开窍方组小鼠较模型组逃避潜伏期缩短(P>0.05).在训练第4天,与模型组比较,对照组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),清心开窍方高剂量组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05),中剂量清心开窍方组小鼠逃避潜伏期较模型组显著缩短(P<0.01).在空间探索试验中,与模型组相比,对照组小鼠跨越平台次数显著增加(P<0.01),清心开窍方中剂量组跨越平台次数增加(P<0.05),与模型组比较,对照组和清心开窍方中剂量组在平台所在目标象限的搜索时间增多(P<0.05).清心开窍方高剂量组、低剂量组与模型组相比,跨越平台次数、平台所在目标象限的搜索时间无显著差别(P>0.05).与对照组相比,模型组小鼠的运动轨迹紊乱,清心开窍方各组表现出选择性搜索平台的倾向,且寻找平台路径与模型组相比更短.各组小鼠的运动速度并无明显差异.
2.HE染色的结果
与对照组相比较,模型组小鼠海马区神经元数目较少,排列较混乱.与模型组相比,清心开窍方各剂量治疗组小鼠海马区神经元数目较多,神经元排列更有序,其中中剂量组表现尤为明显.
3.尼氏染色结果
尼氏染色结果显示:对照组小鼠CA1区的锥体细胞为多层紧密排列,锥体细胞胞浆呈深蓝色,含丰富的尼氏体;与对照组相比,模型组和清心开窍方低剂量组的小鼠海马CA1区锥体细胞数量显著减少,细胞排列较紊乱,尼氏体结构异常,着色较浅;清心开窍方中剂量组和清心开窍方高剂量组的小鼠海马CA1区锥体细胞数量增多,尼氏体肿胀无序排列减轻,尼氏体结构基本正常,着色较深.
4.免疫组化检测结果
模型组小鼠海马区Aβ阳性颗粒表达水平高于对照组(P<0.01).与模型组相比,清心开窍方治疗组的Aβ阳性颗粒表达水平均显著降低(P<0.01).在3个清心开窍方治疗组中,清心开窍方中剂量组的Aβ下降幅度最大,明显大于高剂量组和低剂量组(P<0.01).
5.透射电子显微镜检测结果
对照组小鼠海马CA1区神经元细胞超微结构完整,高尔基复合体发达,可见丰富的线粒体和游离核糖体分布于胞质内,线粒体呈圆形、椭圆形或棒状,嵴结构完整.模型组小鼠海马CA1区神经元课可见不同程度的退行性改变,包括粗面内质网减少、高尔基复合体肿胀扩张、数目减少,线粒体嵴结构模糊或空泡样变性.经治疗干预后,清心开窍方各剂量组海马CA1区细胞神经元超微结构均有有不同程度的改善.清心开窍方中剂量组和高剂量组神经元细胞结构基本完整,线粒体结构清晰,胞质内细胞器较丰富.而清心开窍方低剂量组神经元结构与中剂量组相比,核仁核膜及细胞器均有轻微退变.
6.TUNEL染色结果
Tunel染色结果显示,与对照组相比,模型组海马凋亡细胞数量显著增加(P<0.01).与模型组相比,清心开窍方中剂量凋亡细胞数明显减少(P<0.01).
7.WesternBlot检测结果
WB结果显示,模型组小鼠海马中Aβ1-42蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01).与模型组相比,清心开窍方治疗组的Aβ1-42蛋白表达水平显著降低(P<0.05).清心开窍方高、中、低剂量三个治疗组中,清心开窍方中剂量组Aβ1-42蛋白表达水平明显低于清心开窍方高剂量组和低剂量组(P<0.01).
与对照组相比,模型组小鼠海马区bax和caspase-3蛋白水平明显升高(P[0.01],Bcl-2蛋白水平显著下降(P<0.01).经过中剂量清心开窍方的治疗后,Bax和caspase-3的蛋白质表达水平显著降低(P<0.01),bcl-2的蛋白质表达水平显著增加(P<0.01).
各组之间的ERK1/2总量没有显著差异.与对照组相比,模型组p-ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01).清心开窍方中剂量组p-ERK1/2蛋白水平显著升高(P<0.01).与对照组相比,模型组和清心开窍方中剂量组的JNK1水平显著降低(P<0.01).模型组和清心开窍方中剂量组的JNK1表达水平没有明显差异.在p-JNK1的蛋白表达中可观察到同样的趋势.模型组的总JNK2蛋白水平低于对照组(P<0.05),清心开窍方中剂量组治疗后未有显著改善(P>0.05).模型组P-JNK2蛋白表达水平低于对照组(P<0.01),但与清心开窍方中剂量组相比无明显差异(P>0.05).各组之间的p38MAPK总量没有显著差异.模型组p-p38MAPK蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.01).清心开窍方中剂量组p-p38MAPK蛋白水平显著降低(P<0.01)
8.ELISA检测结果
酶联免疫吸附试验显示,与对照组相比,模型组小鼠海马中cleavedcaspase-3蛋白表达水平显著上升(P<0.01),经中剂量清心开窍方治疗后,cleavedcaspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.01).
结论:
清心开窍方能改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力,抑制神经元凋亡,减轻病理变性.清心开窍方中剂量组通过抑制p38MAPK的和激活ERK1/2而减少神经元凋亡,但对JNK无明显影响.清心开窍方,尤其是中剂量,可减轻AD大鼠的学习记忆障碍,并通过MAPK途径发挥抗凋亡作用.
方法:选用80只SPF级雄性APP/PS1双转基因小鼠(25±3g),用随机数字表法随机分为5组,即模型组,高剂量组,中剂量组和低剂量组,每组20只.另选取20只同背景雄性C57BL/6J小鼠为对照组.所有小鼠于本校SPF级动物房饲养,适应环境7天后进行灌胃,高剂量组,中剂量组,低剂量组分别服用19g/kg/d,9.5g/kg/d及4.75g/kg/d的清心开窍方水煎剂,对照组,模型组分别灌服等体积的生理盐水.连续灌胃90天.治疗完成后,采用Morris水迷宫测试小鼠的空间学习记忆能力.Morris水迷宫包括定位航行实验(逃避潜伏期)和空间搜索实验(穿台次数).Morris水迷宫测试结束后,将各组小鼠经心脏依次灌注生理盐水及4%多聚甲醛固定,用免疫组织化学法观察Aβ在小鼠海马CA1区神经元中的表达,用HE染色法、尼氏染色法和透射式电子显微镜观察小鼠海马CA1区神经元超微结构及其形态学的改变,用Tunel染色法检测海马区神经元细胞的凋亡情况,采用WesternBlot法检测海马区Bax、Bcl-2、caspase-3、p-ERK1/2、ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK及p-p38MAPK的蛋白表达,ELISA法测试cleavedcaspase-3的表达.
结果:
1.Morris水迷宫结果
在4天的定位航行试验训练里,各组小鼠的逃避潜伏期时间随着时间推移呈下降趋势,训练至第3天各组小鼠逃避潜伏期开始趋于平稳.第1天和第2天各组小鼠逃避潜伏期比较无明显差异(P>0.05);训练第3天,模型组小鼠与对照组比较逃避潜伏期逐渐延长,且有统计学差异(P<0.05),中剂量清心开窍方组小鼠较模型组逃避潜伏期缩短(P>0.05).在训练第4天,与模型组比较,对照组小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),清心开窍方高剂量组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05),中剂量清心开窍方组小鼠逃避潜伏期较模型组显著缩短(P<0.01).在空间探索试验中,与模型组相比,对照组小鼠跨越平台次数显著增加(P<0.01),清心开窍方中剂量组跨越平台次数增加(P<0.05),与模型组比较,对照组和清心开窍方中剂量组在平台所在目标象限的搜索时间增多(P<0.05).清心开窍方高剂量组、低剂量组与模型组相比,跨越平台次数、平台所在目标象限的搜索时间无显著差别(P>0.05).与对照组相比,模型组小鼠的运动轨迹紊乱,清心开窍方各组表现出选择性搜索平台的倾向,且寻找平台路径与模型组相比更短.各组小鼠的运动速度并无明显差异.
2.HE染色的结果
与对照组相比较,模型组小鼠海马区神经元数目较少,排列较混乱.与模型组相比,清心开窍方各剂量治疗组小鼠海马区神经元数目较多,神经元排列更有序,其中中剂量组表现尤为明显.
3.尼氏染色结果
尼氏染色结果显示:对照组小鼠CA1区的锥体细胞为多层紧密排列,锥体细胞胞浆呈深蓝色,含丰富的尼氏体;与对照组相比,模型组和清心开窍方低剂量组的小鼠海马CA1区锥体细胞数量显著减少,细胞排列较紊乱,尼氏体结构异常,着色较浅;清心开窍方中剂量组和清心开窍方高剂量组的小鼠海马CA1区锥体细胞数量增多,尼氏体肿胀无序排列减轻,尼氏体结构基本正常,着色较深.
4.免疫组化检测结果
模型组小鼠海马区Aβ阳性颗粒表达水平高于对照组(P<0.01).与模型组相比,清心开窍方治疗组的Aβ阳性颗粒表达水平均显著降低(P<0.01).在3个清心开窍方治疗组中,清心开窍方中剂量组的Aβ下降幅度最大,明显大于高剂量组和低剂量组(P<0.01).
5.透射电子显微镜检测结果
对照组小鼠海马CA1区神经元细胞超微结构完整,高尔基复合体发达,可见丰富的线粒体和游离核糖体分布于胞质内,线粒体呈圆形、椭圆形或棒状,嵴结构完整.模型组小鼠海马CA1区神经元课可见不同程度的退行性改变,包括粗面内质网减少、高尔基复合体肿胀扩张、数目减少,线粒体嵴结构模糊或空泡样变性.经治疗干预后,清心开窍方各剂量组海马CA1区细胞神经元超微结构均有有不同程度的改善.清心开窍方中剂量组和高剂量组神经元细胞结构基本完整,线粒体结构清晰,胞质内细胞器较丰富.而清心开窍方低剂量组神经元结构与中剂量组相比,核仁核膜及细胞器均有轻微退变.
6.TUNEL染色结果
Tunel染色结果显示,与对照组相比,模型组海马凋亡细胞数量显著增加(P<0.01).与模型组相比,清心开窍方中剂量凋亡细胞数明显减少(P<0.01).
7.WesternBlot检测结果
WB结果显示,模型组小鼠海马中Aβ1-42蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01).与模型组相比,清心开窍方治疗组的Aβ1-42蛋白表达水平显著降低(P<0.05).清心开窍方高、中、低剂量三个治疗组中,清心开窍方中剂量组Aβ1-42蛋白表达水平明显低于清心开窍方高剂量组和低剂量组(P<0.01).
与对照组相比,模型组小鼠海马区bax和caspase-3蛋白水平明显升高(P[0.01],Bcl-2蛋白水平显著下降(P<0.01).经过中剂量清心开窍方的治疗后,Bax和caspase-3的蛋白质表达水平显著降低(P<0.01),bcl-2的蛋白质表达水平显著增加(P<0.01).
各组之间的ERK1/2总量没有显著差异.与对照组相比,模型组p-ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01).清心开窍方中剂量组p-ERK1/2蛋白水平显著升高(P<0.01).与对照组相比,模型组和清心开窍方中剂量组的JNK1水平显著降低(P<0.01).模型组和清心开窍方中剂量组的JNK1表达水平没有明显差异.在p-JNK1的蛋白表达中可观察到同样的趋势.模型组的总JNK2蛋白水平低于对照组(P<0.05),清心开窍方中剂量组治疗后未有显著改善(P>0.05).模型组P-JNK2蛋白表达水平低于对照组(P<0.01),但与清心开窍方中剂量组相比无明显差异(P>0.05).各组之间的p38MAPK总量没有显著差异.模型组p-p38MAPK蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.01).清心开窍方中剂量组p-p38MAPK蛋白水平显著降低(P<0.01)
8.ELISA检测结果
酶联免疫吸附试验显示,与对照组相比,模型组小鼠海马中cleavedcaspase-3蛋白表达水平显著上升(P<0.01),经中剂量清心开窍方治疗后,cleavedcaspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.01).
结论:
清心开窍方能改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力,抑制神经元凋亡,减轻病理变性.清心开窍方中剂量组通过抑制p38MAPK的和激活ERK1/2而减少神经元凋亡,但对JNK无明显影响.清心开窍方,尤其是中剂量,可减轻AD大鼠的学习记忆障碍,并通过MAPK途径发挥抗凋亡作用.