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去甲基尼古丁,又名降烟碱(Nornicotine,NOR),一种天然的生物碱,是烟草特有的亚硝胺类(tobacco-specific nitrosamine,TSNAs)致癌物—亚硝基去甲基尼古丁(nitrosonornicotine,NNN)的前体。它能直接诱导吸烟者血浆中蛋白的异常糖基化,能与常用类固醇类药物发生共价反应,影响药效和毒性。因此有效地控制环境中的去甲基尼古丁的含量,对于维护人类健康有着深远的意义。微生物处理该类型的污染是一种高效、可靠和无二次污染的绿色处理方式。因此,筛选高效降解去甲基尼古丁的微生物菌种资源,探索其降解机制机理,充分发挥其降解能力,具有重要的理论意义和应用价值。本研究的意义在于以现有的尼古丁降解菌为研究材料,研究菌株降解去甲基尼古丁的特性,测定降解途径,克隆到两步关键降解酶基因,并通过生物信息学分析与降解尼古丁的差异,从分子生物学、生物化学和生物信息学角度揭示降解去甲基尼古丁的新机制,为去甲基尼古丁引起的环境污染的微生物降解修复及绿色转化提供理论和技术依据。本文采用分子生物学、生物化学和生物信息学,从以下几个方面对去甲基尼古丁的降解进行研究。本实验室从杭州农药厂的活性污泥中筛选到一株新型高效降解尼古丁的菌株Shinella sp.HZN7。在先前的研究中,我们确定该菌株降解尼古丁的途径为吡啶和吡咯烷交叉途径,并通过pSC123转座子突变和影印平板的方法构建了尼古丁降解失活突变株文库,筛选到323株突变株。本研究从323株突变株中筛选出4株具代表性突变株N7-W13、N7-M9、N7-X5和N7-M17进行研究。它们在降解过程中分别负责积累中间产物Nicotine、6HN、6HPON和HSP,即分别丧失了第一步、第二步、第三步和第四步的降解功能。我们用菌株HZN7、N7-W13、N7-M9、N7-X5和N7-M17分别去降解尼古丁和去甲基尼古丁。UV结果显示菌株HZN7不能完全矿化去甲基尼古丁,菌株N7-X5和菌株N7-M17降解去甲基尼古丁的紫外图峰形与菌株HZN7的峰形一致,菌株N7-W13降解去甲基尼古丁则产生了一种与之前三种菌株不一样的新峰形,菌株N7-W13的紫外结果没有发生变化。我们初步推测菌株HZN7中降解去甲基尼古丁与降解尼古丁为同一套基因,且该套基因只负责去甲基尼古丁降解的前两步,并推测前两步的产物为6-羟基-降烟碱(6HNor)和6-羟基肌氨酸(6HM)。为克隆菌株HZN7的去甲基尼古丁降解基因,我们首先需要对菌株HZN7基因组进行分析。使用PacBio RSII高通量测序技术获得菌株Shinellasp.HZN7的基因组完成图,结果显示Shinellasp.HZN7基因组由一条完整染色体序列及十二条质粒序列(命名为pShin-01至pShin-12)组成。利用R语言进行全基因组GC含量分析,发现pShin-05的GC含量远低于全基因组平均水平,疑似为有基因水平转移获得到的质粒。初步推测去甲基尼古丁降解基因位于pShin-05上。利用Snapgene2.3.2软件的Aligend Sequences功能将菌株HZN7基因组序列与目前已报道的6-羟基-尼古丁氧化酶NctB基因序列进行比对。Aligned Sequences比对结果表明NctB位于GC含量偏低的pShin-05上。由于负责特定化合物的生物降解基因往往位于一个基因簇中,负责去甲基尼古丁的第一降解步骤的基因被假定为邻近于nctB基因。在nctB基因的下游,发现两个疑似尼古丁降解基因,我们将其命名为nctA1(468bp)和nctA(2250bp)。NctA1 与来自菌株Ochrobactrum sp.SJY1 的尼古丁羟化酶小亚基VppAs表现出100%的氨基酸相似性。NctA2与来自菌株SJY1的尼古丁羟化酶大亚基VppA1表现出100%的氨基酸相似性。初步推测菌nctA1和nctA2负责将去甲基尼古丁氧化为6HNor,nctB负责将6HNor转化为6HM。进一步利用分子生物学方法验证上述基因功能,将包含nctA1和nctA2基因的片段克隆连接到广宿主载体pBBR1MCS2上,过三亲接合的方式转入不具备去甲基尼古丁降解能力的Pseudomonasputida KT2440,质粒pBB-nctA可以使菌株KT2440获得降解去甲基尼古丁的能力。通过同源重组的方法将菌株HZN7中nctA1和nctA2基因敲除,敲除后的重组子失去了去甲基尼古丁降解能力,而基因回补后又恢复了降解性能。证明该基因编码尼古丁氧化酶(NCTA1A2)催化去甲基尼古丁降解的第一步。然后利用UV,LC/TOF-MS,GC/TOF-MS和NMR对产物进行鉴定,经鉴定产物为6HNor(5-Pyrrolidin-2-yl-pyridin-2-ol)。即尼古丁氧化酶(NCTA1A2)将去甲基尼古丁转化为6HNor。再将6-羟基-尼古丁氧化酶NctB基因连接到表达载体pET29a(+)上,并导入E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,通过亲和层析对表达产物进行了纯化。酶学结果表明NctB能将6HNor转化6HM。同样我们再次通过同源重组的方法将菌株HZN7中nctB基因敲除,敲除后的重组子失去了 6HNor的降解能力,而基因回补后又恢复了降解性能。证明该基因编码6-羟基-尼古丁氧化酶(NCTB)催化去甲基尼古丁降解的第二步。然后利用UV,LC/TOF-MS,GC/TOF-MS和NMR对产物进行鉴定,经鉴定产物为6HM(5-(4,5-Dihydro-3H-pyrrol-2-yl)-pyridin-2-ol)而不是 5-(4,5-Dihydro-1H-pyrrol-2-yl)-pyridin-2-ol。即NctB转化6HNor的脱氢位点为吡咯环上的C7和N11,转化6HN的脱氢位点为吡咯环上的C7和C8。利用生物性信息学工具对6-羟基-尼古丁氧化酶NctB二级结构、活性位点等结构和功能信息进行预测,为功能研究提供必要的理论指导。首先,在SWISS数据库中选择了与NctB氨基酸序列相比覆盖率大于90%相似41.59%的6HLO晶体模型(5ttk.1)为模板进行同源建模,将得到的模型命名为nctB.pdb。RamachandranPlot评估结果显示该蛋白模型允许区域大于98%,即模拟结果较为良好。而后利用autodock vina分子对接软件先后寻找辅因子FAD和底物6HNor与NctB的结合位点。结果显示辅因子FAD与6HNor吡咯环的C7存在氢键,NctB模型中Glu292与6HNor吡咯环的N1 1存在氢键。即NctB通过脱去6HNor吡咯环C7和N11上的氢,进而将6HNor转化为6HM。这与之前通过实验鉴定的6HM结构基本一致。