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目的:研究临床分离的耐碳青霉烯类和多粘菌素B的肺炎克雷伯菌（KP）菌株的毒力和耐药基因特征,并分析耐药菌株的分子同源特性;探究菌株对多粘菌素B的耐药机制以及携带mcr-1基因的转移和传播机制;探究多粘菌素B联合白藜芦醇是否对耐药菌株体外抗菌活性具有协同作用。方法:1.收集南昌大学第二附属医院2018年1月至2019年6月临床分离的107株非重复耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）。采用Vitek2-compact全自动微生物鉴定仪及药敏分析系统对细菌进行鉴定及检测常见抗菌药物的敏感性,用微量肉汤稀释法测定多粘菌素B对菌株的最低抑菌浓度（MIC）。用改良碳青霉烯灭活试验（m CIM）和金属酶初筛试验初步筛查碳青霉烯酶。采用聚合酶链反应（PCR）及测序检测碳青霉烯类耐药基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaSME、bla GES、blaSPM-1、blaSIM-1、blaGIM-1、blaOXA-48、blaOXA-23);ESBLs基因(blaTEM、bla CTX-M、blaSHV);Amp C酶基因(blaAAC、blaCIT、blaDHA、blaEBC、blaFOX、blaMOX);质粒介导的喹诺酮药物耐药基因（acc（6’）-Ib-cr）和多粘菌素B耐药基因（mcr-1-8）。检测耐药菌株高毒力荚膜血清型基因（k1、k2、k5、k54、k57）和常见毒力基因（rmp A、mag A、alls、wcag、aerobactin、iro N、iut A、fim H-1）。利用多位点序列分型（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法分析菌株的分子分型和同源性。2.采用PCR及测序检测PmrA/Pmr B调控系统介导的多粘菌素B耐药基因的突变,实时荧光定量PCR检测多粘菌素B耐药和敏感菌株外排泵acr A基因表达差异。以临床分离的一株携带mcr-1基因的肺炎克雷伯菌为研究对象,通过接合、转化试验阐明耐药基因转移播散机制。提取质粒利用高通量测序技术进行质粒测序、基因环境和比对分析。3.以多粘菌素B耐药的CRKP为研究对象,采用肉汤稀释法测定白藜芦醇对菌株的MIC值,棋盘稀释法实验测定多粘菌素B联合白藜芦醇对菌株的MIC值,探讨多粘菌素B联合白藜芦醇的抑菌效果。结果:1.收集的107株CRKP中,共有15株CRKP对多粘菌素B耐药,耐药率为14.0%。15株多粘菌素B耐药的CRKP对亚胺培南、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢西丁、头孢曲松、复方新诺明、环丙沙星的耐药率均为100%,对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素和替加环素等药物耐药率分别为46.7%、60.0%、53.3%、13.3%。15株实验菌株中有11株菌携带基因KPC-2,两株菌分别携带NDM-1和NDM-5;仅一株菌携带mcr-1;8株菌携带CTX-M-65,3株菌携带TEM-1,全部菌株携带SHV基因。常见的高毒力荚膜血清型基因结果均为阴性,常见的毒力基因rmp A、fim H-1、iut A阳性率分别为53.3%、80.0%、53.3%。ST分型当中,11株为ST11型,其余为ST34、334、485各一株;PFGE结果中,分别为A型4株、B型1株、C型3株、D型2株、E-I型各1株。2.15株多粘菌素B耐药菌株PmrA基因未发生突变,有6株菌pmrB基因发生了突变,检测到在pmrB基因766位点发生由C到G的碱基突变,而敏感组6株菌中,有4株发生该突变。实时荧光定量PCR检测耐药和敏感菌株外排泵acr A基因表达差异时,发现耐药组菌株acr A基因表达的量高于敏感组;一株mcr-1和NDM-5基因共存的肺炎克雷伯菌（N816）可将mcr-1基因接合至受体菌,而NDM-5基因只能转化至受体菌,其接合及转化子均对相应抗生素耐药;质粒测序分析显示含有两个质粒,分别包含mcr-1和NDM-5基因,大小分别约为33kb和46kb,分别与质粒MH715959.1和MK308632.1相似度为98.77%和98.4%。3.多粘菌素B联合白藜芦醇对肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性有协同作用,两种药物联合使用时比单独使用时MIC值降低。结论:1.多粘菌素B和碳青霉烯类同时耐药的肺炎克雷伯菌耐药及多重耐药性严重;携带KPC-2是对碳青霉烯类耐药的主要原因,同时携带SHV和CTX-M-65基因是导致菌株多重耐药的原因;实验菌株携带的毒力基因较少,表明其致病性弱;MLST分型以ST11型为主,发现一株尚未报道的ST型;PFGE结果显示菌株遗传具有多样性。2.pmrB基因突变参与了菌株对多粘菌素B耐药的调控;外排泵acr A基因的高表达与菌株对多粘菌素B耐药相关;研究结果表明,mcr-1基因为质粒介导,该菌株同时携带mcr-1和NDM-5基因尚属首次报道,质粒测序比对显示与质粒MH715959.1和MK308632.1具有一致性。3.白藜芦醇与多粘菌素B联用对菌株体外抗菌活性具有协同作用。