目的:缺血性心脏病每年在全球范围内造成700万的死亡,占疾病致死人数的12.9%,是首要的死因。当发生心肌梗死,使病变血管再通是促进缺血心肌存活的必要前提,但再通的血流也会带来再灌注损伤。动物试验和临床研究证实缺血后的再灌注诱导了致死性心肌细胞损伤,而细胞损伤诱发的心肌梗死占总缺血诱导的心肌梗死50%,25%的PCI治疗患者发生更大的心肌梗死,因此防治再灌注损伤已成为心血管专家面临的巨大挑战。在这个背景下,近年来发现的肠促激素——胰高血糖素样肽-1(GLP-1)展现出良好的应用前景。作为一类新型的治疗糖尿病的药物,GLP-1在动物模型和早期临床实验中均表现出潜在的心血管保护效应,也因此成为缺血再灌注损伤研究的新热点。GLP-1由胰高血糖素原前体经转录后修饰而成,由肠L细胞在进食刺激下分泌。GLP-1的受体属于G蛋白偶联受体家族,GLP-1通过GLP-1R引发的胞内信号通路发挥作用。研究者在人体许多组织中找到GLP-1R,同时发现了GLP-1对许多不同组织发挥生理作用。其中,GLP-1对心血管系统的保护作用受到广泛关注。在心脏,GLP-1通过激动GLP-1R激活c AMP/PI-3K通路发挥抗凋亡作用,因而在缺血再灌注损伤的心肌,给予GLP-1能显著减少梗死面积。再灌注早期及时识别GLP-1R靶点,并给予有效调控,将对临床再灌注损伤治疗起到事半功倍的效果,但目前传统的检测方法无法在活体水平对其识别、指导治疗。本课题组在国际上首次合成了GLP-1R探针18F-FBEM-EM3106B,预实验结果表明该探针可对缺血心肌GLP-1R进行活体成像,但该探针合成复杂、耗时较长同时需要专业放化人员合成,不适合普通推广。因此本课题组拟在心脏中首次利用一步法合成的新型探针18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4,应用micro PET对大鼠心脏GLP-1R进行高特异、高敏感、无创的多模活体成像,并利用分子生物学方法对缺血心肌GLP-1R表达进行验证,揭示大鼠心肌缺血再灌注后GLP-1R的表达变化,实现活体对靶标的早期识别。利用核素探针可视化、定量靶标的变化,不仅为再灌注损伤内在受体活体水平早期识别提供新手段,也为再灌注损伤药物干预提供新靶点。方法:1.大鼠心肌缺血再灌注模型的制备:选取200-250g雄性SD大鼠为实验对象,分为假手术组、再灌注8小时组、再灌注1天组、再灌注3天组、再灌注7天组,腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉,麻醉成功后行气管插管,机械通气,而后开胸,于左心耳下靠肺动脉圆锥处结扎冠状动脉左前降支,深度1-2mm宽度2-3mm,缺血持续30分钟后松开结扎线。假手术组将线穿过冠状动脉左前将至下心肌组织而不结扎,同样在30分钟后撤线。2.大鼠心肌缺血再灌注模型的验证:大鼠在缺血前连接心电向量示波设备,在术中动态观察心电向量的变化,记录。缺血再灌注术后1天,以小动物超声观察大鼠左室搏动情况,测量左室收缩末容积、左室舒张末容积,计算出射血分数,评价左心功能;同日,行大鼠心肌18F-FDG的PET显像,观察大鼠心肌摄取葡萄糖能力,评价心肌活力及残存心肌面积。3.核素示踪剂18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的合成:按照以往合成方法,在药物NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4中引入18F,按照一步合成法操作,而后于分析性HPLC中进行色谱分析,定位其峰值,再于制备型HPLC中纯化产物,得到目标核素示踪剂。4.大鼠心脏18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的PET活体显像:各组大鼠在对应的时间点进行心脏18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的PET显像,由尾静脉注射核素示踪剂,1小时后行PET静态扫描,持续10分钟,以二维有序子集最大期望算法重建图像。该探针特异性检验应用抑制试验即取对照组静脉注射无核素标记的Exendin-4(8mg/kg),经10分钟后再注射18F-Al F-NOTA-MALCys40-Exendin-4,而后再行心脏PET显像。所有PET显像实验均记录注射前放射药物放射剂量、注射时间、注射后针管内残余放射剂量、扫描开始时间以及扫描结束时间,计算每克组织摄取的放射性剂量占注入总放射性剂量的百分比(%ID/g)5.GLP-1R定位双探针成像:为进一步确证该探针高吸收率部位即为缺血损失区,我们应用18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4和18F-FDG双探针成像,即取再灌注1天组大鼠,在18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的PET显像完成后静脉注射18F-FDG,再经过1小时行心肌的PET显像,所得的两个结果进行图像融合。6.分子水平体外检测大鼠心肌GLP-1R表达变化:大鼠在PET显像结束后处死,取缺血部位心肌组织,分别留作蛋白免疫印迹和免疫组化染色。以蛋白免疫印迹法半定量检测缺血部位心肌组织的GLP-1R水平,以免疫组化染色法直观显示大鼠心肌组织里GLP-1R表达的疏密。结果:1.大鼠心肌缺血再灌注模型建立成功:术中心电向量示波监测显示,结扎大鼠冠状动脉左前降支立即引起心电向量图ST段抬高,并在接下来的30分钟内维持早高水平,松开结扎线使心电向量图ST段有所回落,但仍高于术前水平;术后1天大鼠心脏超声检查可见大鼠心室前壁搏动幅度明显降低,测量左室收缩末期容积、左室舒张末期容积后计算左室射血分数,再灌注组术后射血分数(70.4±0.50)%较假手术组(87.4±1.03)%明显下降;术后1天大鼠心脏18F-FDG的PET扫描,结果显示心室前壁放射缺损,表明心室前壁心肌组织低代谢,存活心肌少。2.18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4对大鼠心脏GLP-1R的示踪表现:从矢状面、冠状面、横切面三个面综合观察可见,18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4在大鼠的肺、肾、膀胱、胰腺显影最明显,正常心脏组织由于GLP-1R表达水平不高,显影不清晰。而在缺血再灌注后的心脏,局部18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4显影增强,与周围组织形成对比,提示心脏缺血后GLP-1R表达的上调。阻断实验大鼠心脏显影明显减弱,确证了该探针的高特异性。GLP-1R双探针成像结果发现心肌缺血部位表现为18F-FDG吸收缺损,而18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4心肌高吸收部位与之重叠,证实GLP-1R高表达在缺血部位,验证该探针的高敏感性。3.大鼠心肌缺血再灌注后GLP-1R的表达变化:各组PET显像的结果经过%ID/g校正后,可见心肌缺血处放射增强,与周围组织对比明显,其中再灌注8小时组放射活性最强,自再灌注1天组始逐渐减弱,至再灌注7天组已与对照组相差无几。体外结果表达变化趋势和PTE结果变化趋势一致,共同提示大鼠心肌GLP-1R在缺血再灌注后的表达变化呈现先上升后回落的趋势,在再灌注8小时达到高峰,再灌注7天恢复到近正常水平。结论:1.核素示踪剂F-Al F-NOTA-MAL-Cys-Exendin-4以一步法合成,快速高效,能准确敏感的定位大鼠心肌缺血后GLP-1R受体的表达位点,因而其在帮助发现心肌缺血再灌注新靶点,监测其变化,为临床指导药物干预及药物发展具有良好的应用前景。2.缺血再灌注损伤能激活大鼠心肌缺血部位GLP-1R的表达,其总体趋势是先上升后回落,在再灌注8小时达到顶峰,至再灌注7天恢复至近正常水平。