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研究目的:本文通过网络药理学分析探讨肿节风治疗免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)的可能成分及机制,佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)与抗血小板血清联用模拟ITP临床表现构建体外巨核细胞分化成熟障碍模型,研究肿节风总黄酮改善巨核细胞分化成熟障碍状态,促进巨核细胞分化成熟的作用,探究其可能的作用机制。研究方法与内容:1.网络药理学研究肿节风治疗免疫性血小板减少症的可能成分及机制通过查询数据库,构建肿节风活性成分及药物靶标、免疫性血小板减少症疾病相关靶标数据库,筛选匹配建立“药物-疾病-靶标”数据库,运用GO和KEGG分析匹配到的靶标基因,探讨潜在的活性成分与靶标。2.抗血小板血清对巨核细胞分化成熟的影响效应及机制研究采用MTS法检测不同剂量抗血小板血清(anti-platelet serum,APS)干预24、48、72、96、120 h后的Dami细胞活力。将细胞分为空白对照组、PMA(5ng/ml)组、APS(0.25%、0.5%、1%、2%、4%)+PMA培养96 h,通过Hoechst染色法观察巨核细胞多倍体变化情况,结合流式细胞术对巨核细胞分化成熟表面标记分子(CD41a、CD42b和CD61)表达的检测结果,综合评估APS对巨核细胞分化成熟的抑制作用,并确定构建体外巨核细胞分化成熟障碍模型的条件。通过蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)实验对网络药理学分析得到的MAPK通路关键蛋白(JNK、c-Jun和p38)进行验证,探讨APS抑制巨核细胞分化成熟的作用机制。选用JNK通路抑制剂SP600125干预体外巨核细胞分化成熟障碍模型,流式细胞术检测CD41a与CD61表达变化情况,通过WB实验对JNK信号通路的关键蛋白(JNK、c-Jun)进行验证。进一步证明APS可以通过介导MAPK信号通路抑制巨核细胞分化成熟。3.肿节风总黄酮促进巨核细胞分化成熟研究采用化学发光法检测不同浓度肿节风总黄酮干预Dami细胞24、48、72、96、120 h后的细胞增殖活力,确定干预体外巨核细胞分化成熟障碍模型的药物浓度,设置空白对照组、PMA(5 ng/ml)组、模型组、肿节风总黄酮3.9、7.8、15.6μg/ml组,培养96 h。采用流式细胞术检测巨核细胞分化成熟表面标记分子(CD41a、CD42b和CD61)表达变化情况,并通过WB实验对关键蛋白(JNK、c-Jun)进行验证,探讨肿节风总黄酮改善巨核细胞分化成熟障碍状态的可能机制。考虑到肿节风总黄酮经生物体吸收转化等因素,制备肿节风总黄酮经时含药血浆干预模型,流式细胞术检测CD41a与CD61表达变化情况,进一步验证肿节风总黄酮改善巨核细胞分化成熟障碍状态的结果。研究结果:1.网络药理学分析发现肿节风通过槲皮素、β-谷甾醇和脱水淫羊藿素等多种活性成分作用于AKT1、SRC、MAPK1、JUN、HSP90AA1、RELA、ESR1、TNF、MYC、FOS、MAPK14、CCND1、STAT1等核心靶标发挥治疗免疫性血小板减少症的作用,以P-value<0.05和FDR<0.05筛选,得到显著富集GO条目共370条,肿节风可能是通过RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控,对药物的反应,负调控凋亡过程,信号转导,蛋白质结合,酶结合等治疗免疫性血小板减少症。以P-value<0.05和FDR<0.05筛选,得到114条显著富集的KEGG信号通路,推测肿节风可能是通过介导MAPK、PI3K-Akt、TNF和Toll样受体等信号通路起到治疗免疫性血小板减少症的作用。2.APS能够抑制Dami细胞增殖活力,且呈剂量依赖性,Hoechst染色结果显示APS抑制Dami细胞多倍体化,显著抑制巨核细胞表面标记分子(CD41a、CD42b、CD61)表达,且呈剂量依赖性,提示APS能抑制巨核细胞分化成熟,成功构建体外巨核细胞分化成熟障碍模型。WB结果显示,JNK、c-Jun和p38磷酸化水平较PMA组显著提高(P<0.05)。而使用SP600125干预体外巨核细胞分化成熟障碍模型,流式细胞术检测发现相比于模型组Dami细胞表面CD41a、CD61表达增加,WB实验结果显示,JNK及其下游靶点c-Jun的磷酸化在SP600125的作用下显著下调,SP600125能缓解APS对巨核细胞分化成熟的抑制作用可能与抑制MAPK信号通路有关。APS抑制巨核细胞分化成熟可能是通过激活MAPK信号通路发挥作用。3.高浓度肿节风总黄酮对Dami细胞增殖活力有显著抑制作用,呈剂量依赖性。依据细胞增殖活力实验结果,选择3.9μg/ml、7.8μg/ml和15.6μg/ml做为干预模型的药物浓度。流式细胞术检测结果表明,肿节风总黄酮能显著促进模型中Dami细胞CD41a、CD42b和CD61的表达。WB实验显示,相较于模型组,肿节风总黄酮7.8和15.6μg/ml组的JNK及下游靶点c-Jun磷酸化水平显著下调(P<0.01)。肿节风总黄酮经时含药血浆干预模型后,流式细胞术检测结果显示经生物体吸收转化后,肿节风总黄酮仍可以促进巨核细胞表面标记分子(CD41a、CD61)的表达,进一步验证肿节风总黄酮改善巨核细胞分化成熟障碍状态、促进巨核细胞分化成熟的作用。研究结论:1)通过网络药理学分析肿节风治疗免疫性血小板减少症的作用机制,可能是通过活性成分槲皮素、β-谷甾醇、脱水淫羊藿素、琥珀酸、咖啡酸等,作用于核心靶点AKT1、SRC、MAPK1、JUN等,RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控,酶结合等调控MAPK、PI3K-Akt、TNF等信号通路发挥治疗作用。2)抗血小板血清可能通过促进JNK、c-Jun和p38的磷酸化激活MAPK信号通路,抑制巨核细胞分化成熟,成功构建体外巨核细胞分化成熟障碍模型。3)肿节风总黄酮可能通过调节MAPK信号通路改善巨核细胞成熟抑制状态,促进巨核细胞分化成熟。