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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。该病最早于1987年报道于美国南部,现已遍及世界各地,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。
2006年,我国暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的“猪高热综合症”。通过国内学者的大量研究,证实高致病性PRRSV变异株是“猪高热综合症”的主要病原。针对这种新的PRRS,本研究开展了病毒的分离与鉴定,分析了分离毒株与国内外代表毒株的遗传进化关系,建立了RT-PCR诊断方法,并对其主要免疫原性基因ORF5进行了修饰与改造。主要研究内容包括
1.高致病性PRRSV的分离、鉴定
利用Marc-145细胞对“猪高热综合症”期间发病猪的组织样品进行病毒分离,并通过RT-PCR、电镜观察以及间接免疫荧光等试验证实分离的病毒为PRRSV。对分离的毒株WUH1、HG、GD、XA进行了本动物回归试验,结果人工感染猪表现出与临床上“猪高热综合症”一致的临床症状,感染猪发病率达100％,死亡率高达80％,从而确定分离的这四株毒株均为高致病性PRRSV。
2.高致病性PRRSV WUH1株的全基因组序列分析
通过RT-PCR分段扩增并测定了PRRSV WUH1株的全基因组序列,序列分析结果表明:WUH1株属于美洲型毒株,其基因组两端非编码区5’UTR和3’UTR各存在一个碱基的缺失,且Nsp2蛋白中存在30个氨基酸的不连续缺失。与国内分离的变异株JXA1的基因组同源性高达98.7％。遗传进化分析表明WUH1与国内高致病性PRRSV亲缘关系较近,有着共同的祖先。
3.华中地区PRRSV分离株Nsp2、ORF3和ORF5基因的序列特征分析
对从华中地区分离的18株PRRSV分离株的Nsp2、ORF3和ORF5基因进行序列分析,结果表明:有17株病毒的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与WUH1相同,只有1株未发生此缺失。根据所建立的遗传进化树确定这17株分离株与高致病性PRRSV的亲缘关系较近,而另外1株被确定为疫苗株。同时还发现高致病性PRRSV ORF5基因编码的GP5蛋白中的多处关键氨基酸位点都发生了突变。GP3的抗原表位中的氨基酸发生了突变。
4.PRRSV变异株RT-PCR检测方法的建立
为了便于鉴别高致病性PRRSV和经典毒株,参考经典毒株及高致病性毒株的基因序列,在Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,经典毒株扩增片段为508bp,而高致病性PRRSV扩增片段为418bp,建立了能区分高致病性PRRSV和经典PRRSV的RT-PCR诊断方法。试验证明该方法特异性良好,敏感性高。用此方法对华中地区PRRSV的流行情况进行了调查,表明华中地区PRRSV阳性率高达60.45％,且流行毒株主要为高致病性PRRSV变异株。
5.重组毒株Em2007的全基因组及致病性分析
在临床病料检测时发现了Nsp2基因存在更多缺失的毒株,分离该毒株并命名为Em2007。全基因组序列分析发现:Em2007的Nsp2存在连续68个氨基酸的缺失,是一种新的Nsp2缺失变异株,且其5’端非编码区有一个碱基的缺失。进一步的遗传进化分析表明,Em2007是一株潜在的自然重组毒株,全基因组存在3个同源重组区域,其亲本分别为WUH1和CH-1R。通过本动物的人工感染试验,发现Em2007的毒力明显强于CH-1a,但较WUH1株弱。
6.中国大陆PRRSV的遗传变异分析
对高热病期间分离的82株PRRSV分离株的ORF5基因进行了序列测定和遗传进化分析,发现这些流行毒株均为美洲型毒株。同经典的PRRSV相比,糖基化位点的数量明显增多,位置也发生了变化,而且抗原性也不同于以前的疫苗株。收集了GenBank数据库中1996-2008年间我国所有PRRSV分离株的全基因组序列和ORF5基因序列,从全基因组和ORF5基因两个方面对PRRSV在我国的流行规律及遗传进化关系进行了综合的分析,发现目前我国至少存在4种遗传关系不同的亚群。
7.人工合成的修饰型高致病性PRRSV ORF5基因的免疫原性研究
为了获得用于研制高致病性PRRSV新型疫苗的良好靶基因,针对高致病性PRRSV变异株ORF5基因的特征,将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸序列插入高致病性PRRSV ORF5的中和表位和诱骗表位间,将中和表位两端的糖基化位点(N30、N34、N35和N51)消除,并对ORF5基因进行了密码子优化,获得修饰的ORF5基因(SynORF5)。通过DNA疫苗免疫的方式证实:同表达天然ORF5基因的DNA疫苗相比,表达SynORF5基因的DNA疫苗能诱导免疫小鼠及仔猪产生显著增强的GP5蛋白特异性的ELISA抗体、PRRSV特异性的中和抗体和细胞免疫反应,表明修饰型SynORF5基因具有更好的免疫原性,可作为高致病性PRRSV新型疫苗开发的候选靶基因。