1、交感神经系统在孕期寒冷刺激对子代大鼠血压的影响中的作用研究1.1研究背景高血压是多种心血管病及患者死亡的重要原因。越来越多的证据表明环境温度与血压密切相关。流行病学显示环境因素不仅影响个体,与子代疾病的发生也存在密切联系。如妊娠期高血压会提高子代心血管病发生的风险,我们以前的研究表明孕期不良刺激如感染、炎症会导致子代血压升高,孕期寒冷刺激可以诱导子代生长发育受限、神经行为异常和免疫功能受限。但是目前为止孕期寒冷刺激是否会导致子代血压升高尚不清楚。此外,寒冷刺激可以诱导的妊娠期高血压和先兆子痫的个体中存在中枢和外周交感神经的兴奋,而长时间的交感神经系统和肾素-血管紧张素系统激活会对宫内胎儿的发育造成损伤。因此,我们推测孕期寒冷刺激可能会引起子代血压升高,这种升高可能是由于中枢及外周交感神经过度兴奋有关。1.2研究目的分析孕期寒冷刺激子代血压升高的作用,探索寒冷子代血压升高的中枢改变原因机制,进一步完善寒冷在高血压的发病机制理论,为防治寒冷子代血压升高提供治疗靶点和预防措施。1.3研究方法本实验采用8-10周左右的SD大鼠于孕期给予每天8小时2-6℃低温刺激,子鼠出生后自第4周起连续观察血压变化情况。利用鼠尾无创套尾法测量大鼠尾动脉收缩压,代谢笼法测量尿量和尿钠,在体记录心率变异性（Heart rate variability,HRV）、交感神经受体拮抗剂（外周α₁、β受体拮抗剂、中枢α₂受体激动剂）灌胃观察动脉收缩压变化,手术离断肾交感神经观察收缩压、尿量、尿钠变化、蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测室旁核（Paraventricular nucleus,PVN）中血管紧张素1型受体（Angiotensin II type 1 receptror,AT₁）改变、G蛋白耦联受体激酶4（G-protein coupled receptor kinase4,GRK4）改变,采用磁共振波普成像（Magnetic resonance spectrum imaging,MRS）观察室旁核内代谢改变,使用立体定位仪进行下丘脑室旁核核团定位微量注射AT₁R拮抗剂氯沙坦,心电监护记录大鼠收缩压、心率（Heart rate,HR）变化、酶联免疫实验测定室旁核内炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α表达、免疫组化实验观察室旁核AT₁R改变和PVN内兴奋性谷氨酸能神经元受体GRIN2B和抑制性γ-氨基丁酸能神经元受体GAD65的表达。1.4研究结果1、与正常大鼠子代相比,孕期寒冷刺激组子代收缩压、舒张压、平均动脉压自8周起较正常组明显升高（P<0.05）。2、与正常大鼠子代相比,孕期寒冷刺激组子代大鼠比正常子代大鼠尿量、尿钠较正常组明显减少（P<0.05）。3、寒冷刺激组子代大鼠心率（HR）、心率变异性（HRV）明显增大（P<0.05）。4、分别给予孕期寒冷刺激组子代、正常子代α1受体拮抗剂哌唑嗪（1mg/kg*d）、β受体拮抗剂普萘洛尔（30mg/kg*d）、α2受体激动剂可乐定（0.2mg/kg*d）灌胃处理均可引起SBP下降,但寒冷刺激组较正常组下降明显（P<0.05）,同时与正常子代相比,灌注阻滞剂后寒冷刺激组子代尿量尿钠明显升高（P<0.05）。5、手术离断孕期寒冷刺激组子代、正常子代肾动脉周围交感神经,1周后可见寒冷刺激组子代SBP明显下降（P<0.05）,尿钠、尿量明显增多（P<0.05）,正常子代SBP、尿量、尿钠波动不明显。6、室旁核部位的磁共振波普成像（MRS）显示寒冷刺激组子代N-乙酰天门冬氨酸（NAA）/肌酐（Cr）值较正常组子代明显降低（P<0.05）,胆碱（Cho）/肌酐（Gr）值较正常子代明显升高（P<0.05）。7、免疫印记实验和免疫组化实验检测可见寒冷刺激组子代室旁核AT₁受体含量比正常组子代明显升高（P<0.05）。分别在寒冷刺激组子代、正常组子代室旁核内微量注射AT₁受体拮抗剂氯沙坦,均可引起SBP下降,但是寒冷刺激组子代比正常组子代下降更加明显（P<0.05）。8、免疫组化实验检测可见室旁核内兴奋性谷氨酸能神经元受体GRIN2B寒冷刺激组子代比正常组子代明显升高（P<0.05）,抑制性谷氨酸能神经元受体GAD65寒冷刺激组子代比正常组子代明显减少（P<0.05）9、ELISA检测室旁核IL-1、IL-6、TNF-α含量可见寒冷刺激组子代比正常组子代明显增高（P<0.05）。1.5研究结论孕期寒冷刺激可以引起子代室旁核神经元细胞性升高、RAAS系统激活和炎症介质升高,导致肾交感神经兴奋,进而肾脏水钠排泄功能受损,导致子代血压升高2、血管功能在孕期寒冷刺激对子代大鼠血压的影响中的作用研究2.1研究背景我们之前的研究表明外界不良刺激如感染、空气污染致子代的血压升高与血管舒张功能的受限有关,主要由于G蛋白偶联受体激酶4激活介导的多巴胺受损引起。而血压的升高与血管外周阻力密切相关,其中肠系膜动脉是形成血管外周阻力的重要组成部分,因此,我们推测孕期寒冷刺激可能会引起子代血压升高,这种升高可能是由于血管舒张功能改变有关。2.2研究目的分析孕期寒冷刺激子代血压升高中血管舒张功能是否发生改变,探索寒冷子代血压升高的血管功能改变原因机制,为阐明子代高血压的发病机制提供理论依据。2.3研究方法孕期寒冷刺激子代大鼠于16周龄检测肠系膜动脉血管功能,观察肠系膜动脉基础状态和去内皮前后对Ach、Fenoldopam介导的血管舒张反应性,蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测血管中多巴胺1型受体（Dopamine type 1 receptor,D1R）受体改变、包浆包膜中D1R变化和G蛋白耦联受体激酶4（G-protein coupled receptor kinase4,GRK4）改变,免疫共沉淀方法检测D1R磷酸化改变。2.4研究结果1、与正常组子代大鼠相比,孕期寒冷刺激组子代大鼠由Ach介导的肠系膜动脉舒张程度减弱（P<0.05）,且这种反应呈现内皮依赖性,寒冷组子代由D1受体激动剂Fenoldopam介导的肠系膜动脉舒张程度也减弱（P<0.05）,但这种反应呈现非内皮依赖性。2、免疫印记实验显示肠系膜血管内寒冷刺激组子代D1受体含量比正常组子代减少（P<0.05）,其中细胞膜上D1受体减少明显（P<0.05）,细胞浆内D1受体增多（P<0.05）。3、免疫共沉淀实验发现和正常组子代大鼠相比,寒冷刺激组子代肠系膜血管D1受体磷酸化水平明显升高,同时GRK4含量比正常子代增高（P<0.05）。4、免疫印记实验显示肠系膜血管内寒冷刺激组子代D1受体含量比正常组子代减少（P<0.05）,其中细胞膜上D1受体减少明显（P<0.05）,细胞浆内D1受体增多（P<0.05）。2.5研究结论孕期寒冷刺激使子代肠系膜动脉GRK4表达升高,诱导D1R内化和表达减少,导致血管舒张功能降低,进而引起子代的血压升高。3、全文结论孕期寒冷刺激室旁核内RAAS系统激活,炎症介质升高,神经元兴奋性增高,并引起全身交感神经兴奋,高活性的交感神经一方面导致水钠排泄障碍,另一方面致小动脉GRK4表达增加,促进D1受体表达下降和内化,动脉舒张反应性降低,最终引起外周血压升高。