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木霉(Trichooderma spp.)作为生防真菌在林木病害的生物防治中应用广泛,为了能更好的发挥其生防作用,了解木霉在抵御病原真菌胁迫时的内在机制尤为重要。为了探究棘孢木霉CGMCC11653菌株MYB36转录因子调控杨树叶枯病病原菌链格孢菌(Alternaria alternata)毒素胁迫的分子机制,本研究开展了转录组测序,建立遗传转化体系,酵母单杂交等一系列分子生物学实验。首先,建立了木霉在链格孢菌毒素胁迫下的转录组,分析发现不同时间点下木霉调控的基因及其生物学过程有很大差异。毒素胁迫木霉12 h前,各类抗病基因变化并不明显;但在胁迫48 h后,木霉调控了大部分抗病相关基因做出反应:包括ABC转运蛋白ABC1(3.44倍)、几丁质酶基因Chitinase5(1.87倍)、细胞色素P450基因Cyp4(4.38倍)、热激蛋白基因Hsp1(2.41倍)、葡聚糖基因Glucan16(2.91倍)、流出蛋白基因EP2(3.90倍)和水解酶基因Hydrolase 79(5.94倍)等。当木霉受到链格孢菌毒素胁迫时,棘孢木霉MYB家族转录因子表达量变化明显,表明MYB转录因子在响应病原菌毒素胁迫过程中可能起重要作用。挑选5个木霉基因组,将其中与TasMYB36同源的42个MYB转录因子进行了比较分析:在系统发育树上,它们分布在1 1个支系中;42个MYB转录因子含有62个DNA结合区,氨基酸序列保守,与植物中的氨基酸序列不同。半定量结果显示,5个MYB转录因子(MYB25、MYB27、MYB36、MYB38、MYB58)表达差异显著,并对这5个表达量差异显著的MYB转录因子利用RT-qPCR进一步验证,结果表明MYB转录因子的表达量与转录组数据基本保持一致。在荧光定量数据中,转录因子MYB36在毒素胁迫12 h之前的表达量一直下调且在12 h表达量达到最低,转录峰值是处理前的2.25倍;之后表达量开始上调,在48 h上调至最大值,其转录峰值是对照组的2.39倍。经试验对棘孢木霉原生质体制备体系进行优化:选用24-36 h的新鲜菌丝,无菌水清洗菌丝并用NaCl冲洗;崩溃酶的工作浓度为10 mg/mL,4 h为裂解原生质体的最佳时间。利用原生质体沉淀法建立了棘孢木霉CGMCC11653的转化体系,浓度为107个/mL的原生质体100 μL+30 μL质粒转化再生培养12 h后,得到了 4株阳性转化子T1-T4。通过酵母单杂交技术筛选与转录因子特异性结合的DNA序列,我们发现了TasMYB36转录因子识别的6个DNA序列,包括一个未知的新元件“TCCCATCGAT”。此外,我们还发现TasMYB36转录因子所结合的元件“MRS1”与植物体内能结合的元件很不相同,“MRS1”元件与MYB36蛋白结合的核心碱基为“ACAT”。同时,我们统计了MRS1元件在棘孢木霉基因组上的抗病基因启动子,MRS1元件大量分布于相关抗病基因的启动子区域,例如:ABC转运蛋白和大量水解酶类等等。综上所述,本研究所获得的结论与结果为进一步深入了解棘孢木霉MYB转录因子调控毒素胁迫的信号网络奠定了基础。