溶菌酶(lysozyme,LYZ)是一种广泛存在于微生物、动植物和人体中的天然抗菌物质,可以非特异性地溶解致病菌细胞壁中的黏多糖。溶菌酶在一定程度上可以代替抗生素,减少细菌耐药性带来的危害,具有良好的应用前景,如饲料、化妆品、药品领域。它主要是通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细菌细胞壁裂解死亡,因此也叫做N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶主要作用对象是肽聚糖层较厚的革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性菌的抗菌效果较差。目前市售溶菌酶主要利用化学分离方法从蛋清中获取,来源有限,化学提取的纯度较低、损失大,同时溶菌酶作为一种非广谱抗菌剂,应用存在局限性。目的:本实验选用较为成熟的毕赤酵母表达系统,通过发酵表达来获取更高产量高活力的蛋清溶菌酶,满足现行市场的工业需求。此外,扩宽蛋清溶菌酶的抗菌谱,更有利于产品的市场推广和应用,同时也为蛋白质的分子改造和性能优化提供理论参考。方法:采取密码子优化的策略,获得高效表达蛋清溶菌酶的酵母菌株。首先依据酵母菌属的密码子偏好性,对蛋清溶菌酶的ORF序列(Gene ID:396218)进行了部分碱基替换,使其更适于酵母表达体系的新的优化基因。利用无缝克隆技术将优化后的目的基因连接至NotⅠ和Eco RⅠ酶切后的分泌型真核表达载体p PIC9K中,构建重组质粒p PIC9K-co EWL。测序验证后,重组质粒经SalⅠ酶切线性化后电转至酵母感受态细胞GS115中,MD平板和G418抗性平板相继筛选后,获得了一株酵母转化子(G-p-co EWL)。在28℃、p H 6.0、转速240rpm和甲醇浓度1%的条件下诱导表达。相比革兰氏阳性菌,阴性菌的细胞壁最外层是以脂类物质为主要成分的外膜,肽聚糖含量较低,这种差别可能是蛋清溶菌酶对G~-几乎没有抗性的原因。扩宽蛋清溶菌酶的抗菌谱,基于此本实验在蛋清溶菌酶的末端添加了四种不同疏水短肽,其氨基酸列来源于大豆酶解产物Val-Val-Tyr-Pro,β-乳球蛋白酶解产物Ile-Ile-Ala-Glu-Lys,螺旋藻提取物Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys,榛仁Phe-Leu-Leu-Pro-His,实验中表明这些短肽在降脂过程中发挥一定作用。首先根据毕赤酵母密码子偏好性翻译出碱基序列,设计合适的下游引物序列,采用PCR反应将3肽以及5肽的碱基序列连接至蛋清溶菌酶的3’端,直接交由公司合成添加7肽序列的目的基因。同样地将四段目的基因利用无缝克隆技术与酶切后的p PIC9K载体连接,线性化后电转至毕赤酵母感受态细胞中。抗性筛选后获得4株酵母重组子,在28℃、p H 6.0、转速240rpm和甲醇浓度1%的诱导条件下,发酵表达获得添加短肽的蛋清溶菌酶产物。选取三种G+菌四种G-菌作为被试菌,对新型溶菌酶的抗菌谱进行测定评估。结果:经抗性筛选后,获得一株对G418的抗性浓度高达15mg/m L的酵母转化子G-p-co EWL瓶摇培养72h,实现了蛋清溶菌酶的分泌表达,SDS-PAGE电泳结果出现14.4 k Da目的条带,瓶摇发酵上清中总蛋白质量分数为607 mg/L,酶活达到677 U/m L。测序结果显示四种不同疏水短肽均成功连接在蛋清溶菌酶末端,转化至酵母后筛选获得酵母转化子,诱导表达获得四种新型溶菌酶CH1、CH2、CH3、CH4,SDS-PAGE结果出现目的蛋白条带。抑菌试验结果表明,发酵上清均对革兰氏阴性菌展现出强于酶标准品的抗性,其中CH4的抑菌杀菌效果最为明显,同时维持了对革兰氏阳性菌的抗性作用。