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背景与目的人参皂苷是人参、三七等中药材的主要有效成分。人参皂苷Rb1ginsenosideRbl,GRb1)是其中含量最丰富的人参皂苷单体之一。研究发现GRb1具有抗氧化、抗凋亡、调节炎症反应、促进神经递质释放等作用,对多种中枢神经系统(central nervous systerm, CNS)疾病具有治疗作用。但其分子量大、水溶性的分子结构特点以及在肠道内容易降解、有首过消除效应等药代动力学特点致使其口服等常规给药方式生物利用度低。经鼻给药具有给药方便无创、吸收迅速的特点,并且可以使药物绕过BBB直接进入脑实质,目前已成为广泛接受的脑靶向给药方式之一。自噬(autophagy)的概念由Christian de Duve于20世纪60年代提出,是一种在进化中高度保守的,用于批量降解胞浆内容物,如长寿命蛋白及细胞器的过程。在正常生理情况下,自噬处于低水平,用于维护细胞内环境的稳定。在出现营养或生长因子缺乏、内质网应激、细胞内异常产物堆积等情况下,自噬过程被激活。自噬的调控机制和在各种生理、病理情况下的作用是近几年生命科学领域新的研究热点之一本研究观察GRb1经鼻给药后在大鼠脑组织中的药物分布特点,评价此给药方式的脑靶向性;研究经鼻给予GRb1对大鼠实验性脑梗死模型的治疗作用,并对GRb1对脑梗死后自噬过程的可能影响进行初步探讨。方法建立体外神经元谷氨酸兴奋性毒性模型。选择合适浓度的谷氨酸损伤后立即分别加入GRbl 1.2、12或120μM共同作用2 h。通过MTT的方法验证GRb1对谷氨酸损伤的保护作用。成年雄性SD大鼠分别经鼻和经静脉给予GRb1 12.5 mg/kg,在给药后5、15、30、60、120、180 min处死,留取血浆和脑组织。采用HPLC-MS/MS的方法,检测GRb1血浆和脑组织各分区(嗅球+嗅束、皮层、海马、延髓以及小脑)中的含量,采用药物靶向性指数(drug targeting index, DTI)评价经鼻GRb1的脑靶向性。大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)后立即经鼻给予3Rb1 1.25 mg/kg,12.5 mg/kg或者等体积生理盐水,在给药后24 h处死,采用TTC, Nissl、TUNEL染色以及Evans blue渗漏试验等方法观察经鼻GRbl对梗死体积、梗死后神经元变性、血脑屏障损伤的影响,确定经鼻给予GRb1的有效剂量,评价其对脑梗死超急性期和急性期的疗效。大鼠MCAO后立即经鼻给予GRb1 12.5 mg/kg,此后每日一次,共14 d。在梗死后第1、2、3、5、7、14 d进行神经功能缺损评分(modified neurological severity score, mNSS)。在梗死后14 d处死大鼠,进行HE染色,计算梗死体积;利用激光共聚焦显微镜,观察梗死周边区FITC-dextran灌注的血管数目。评价重复经鼻给予GRb1对梗死急性期后脑组织修复的影响。大鼠MCAO后立即经鼻给予GRb1 12.5 mgkg,在梗死后0、1.5、6、12、24h处死。采用western blot、real-time RT-PCR、透射电镜的方法,观察GRb1对大鼠脑梗死后梗死灶周边区神经细胞超微结构以及LC3、Beclin 1的表达的影响,探讨GRb1对脑梗死治疗作用的可能的新的机制。结果在作用时间固定的情况下,随着谷氨酸钠浓度的升高,皮层神经元活力逐渐下降。GRb1能够明显减轻5 mM谷氨酸对体外培养皮层神经元的损伤。在12μM时保护作用最大。GRb1经鼻给药后5 min即可在血浆中检出,其血浆生物利用度为1.40%。同样,GRb1在给药后5 min在脑组织各分区内达到高峰,随后逐渐下降,但给药后60 min后在皮层、海马等区域GRb1浓度再次升高。经鼻GRb1在脑组织各分区内的DTI为7.35至23.22,表现出明显的脑靶向性。大鼠MCAO后立即经鼻给予GRb1能够明显缩小梗死体积,在一定剂量范围内效果与剂量呈正相关。经鼻GRb1 12.5 mg/kg可以明显减轻梗死周边区神经元损伤,减少TUNEL染色阳性细胞数并减轻梗死侧皮层Evans blue渗漏。大鼠MCAO后连续给予GRbl 14 d过程中,在1-3 d mNSS显著低于对照组,在14d仍有低于对照组的趋势;GRb1组梗死体积明显小于对照组;梗死周边区微血管数量和对照组相比无明显差异。GRb1能调节大鼠MCAO后激活的自噬,使梗死后LC3、Beclin 1的水平较对照组先升高然后下降。结论本研究结果表明,GRb1在体外能够减轻谷氨酸兴奋性毒性造成的神经元损伤;GRb1经鼻给药后能迅速进入脑组织,并表现出明显的脑靶向性;经鼻GRb1能够缩小脑梗死体积、减轻神经元和微血管损伤、改善梗死后mNSS,但对梗死后梗死周边区血管再生无明显影响,提示GRb1对大鼠脑梗死治疗作用的主要机制是其神经和血管保护作用。更深入的研究发现,GRb1对梗死周边区自噬的活性具有调节作用。人参皂苷经鼻给药是一种快捷有效的CNS疾病治疗方法,具有良好的临床开发和应用前景。