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我们前期的研究结果显示,单侧前牙反（牙合）（Unilateral anterior crossbite,UAC）可导致颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA）,髁突软骨出现软骨基质丢失、软骨厚度变薄等退行性改变,因此UAC髁突软骨中可能存在软骨细胞的异常分化。而在生长板软骨中钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/Calmodulin dependent protein kinaseⅡ,Ca MKⅡ)是软骨细胞从增殖走向分化的关键。Ca MKⅡ是钙调素依赖性蛋白激酶（Ca MKs）家族中一个非常重要的多功能性激酶,受Ca2+/Ca M蛋白复合体变构激活后,全酶的活性中心和底物结合位点便暴露出来,从而具备了磷酸化底物的能力。印第安刺猬蛋白（Indian hedgehog,Ihh）是Ca MKⅡ下游一个非常重要的信号分子,Ca MKⅡ活化后通过激活Ihh促进软骨细胞从增殖走向分化。在生长板软骨中,Ihh与甲状旁腺激素相关蛋白（Parathyroid hormone-related protein,PTHr P）之间存在着负反馈调节,Ihh活性的增强可促进软骨膜细胞或处于早期分化阶段的软骨细胞合成和分泌PTHr P,而PTHr P通过控制早期分化阶段软骨细胞的分化而减少分泌Ihh细胞的数量,从而发挥负反馈调节Ihh的功能。本研究围绕1)UAC刺激对髁突软骨中Ca MKⅡ表达的影响特点及其与Ihh-PTHr P信号轴的关系,2)通过采用TMJ局部注射Ca MKⅡ抑制剂KN93的方法来观察Ca MKⅡ对髁突软骨的影响这两个方面展开研究,探讨Ca MKⅡ在UAC所致大鼠髁突软骨退变中的作用。目的:研究实验性单侧前牙反（牙合）所致大鼠退变髁突软骨中Ca MKⅡ的表达变化及TMJ局部抑制Ca MKⅡ后对髁突软骨的影响。方法:把6周龄的SD雌性大鼠96只按照随机的原则等分为对照组（Con）、对照注射组（Con+KN93）、实验组（UAC）和实验注射组（UAC+KN93）,其中实验组大鼠左侧上下切牙各戴一套筒冠使其形成单侧前牙反（牙合）关系,注射组大鼠分别于实验开始后4周或8周向双侧TMJ内注射Ca MKⅡ的竞争性抑制剂KN93,每两日注射1次,连续注射4周,对照组大鼠不进行任何处理。实验开始后8周和12周进行取材;苏木精/伊红（HE）染色、番红O/固绿（SO）染色和冯·库萨（van kossa）染色用于观察大鼠TMJ髁突软骨的组织学形态变化;透射电子显微镜（TEM）用于观察软骨细胞超微结构的改变;免疫组织化学（IHC）染色观察Ihh和PTHr P在髁突软骨中的分布及其阳性细胞百分数的变化;Real-time PCR检测Ca MKⅡ、Ihh/Patched、PTHr P/PPR及其它与增殖、分化相关基因的表达变化,Western blot检测磷酸化的Ca MKII蛋白和Ihh-PTHr P信号通路相关蛋白的表达变化情况。结果:（1）与同期对照组（Con）相比,8周和12周实验组（UAC）大鼠髁突软骨的全层厚度及软骨肥大层厚度变薄,软骨细胞的密度下降,软骨中SO染色阳性面积减少,肥大浅层有钙盐沉积的软骨细胞的数量广泛增多,衰老及凋亡的肥大软骨细胞的数量也增多,且这些变化有随UAC刺激时间的延长而加重的趋势;实验组（UAC）髁突软骨中Ca MKⅡ和Ihh m RNA及蛋白的表达水平在两个时间点均明显上调;Ihh的受体Patched m RNA及蛋白的表达水平在8周时没有明显变化,在12周时出现下调;8周时软骨中PTHr P的m RNA和蛋白的表达水平升高,而在12周时出现了明显的下降,软骨中PTHr P的受体PPR m RNA和蛋白的表达水平在两个时间点都下调;实验组（UAC）髁突软骨中与软骨基质合成相关的分子Col2a1、Aggrecan以及与软骨细胞增殖相关的分子Pcna的m RNA表达水平在两个时间点均下调,与软骨基质降解相关的酶Admnts5、MMP-13及与分化相关的分子Ocn、Alp的m RNA表达水平在8周时上调,而12周时则下调。（2）与同期对照组（Con）相比,8周和12周的对照注射组（Con+KN93）大鼠髁突软骨的全层厚度及软骨的肥大层厚度变薄,软骨中SO染色的阳性面积减少。软骨中Ca MKⅡ及Ihh-PTHr P信号相关分子的m RNA和蛋白的表达水平都显著下调;与分化相关分子Alp、Ocn及与软骨基质相关的分子Aggrecan、Adamts5和MMP-13的m RNA表达都出现了有统计意义的减少。两个时间点的对照注射组（Con+KN93）髁突软骨中Col2α1 m RNA表达水平虽有所下降但却没有统计学意义,同样与增殖相关的分子Pcna m RNA的表达水平虽有所上升但也没有统计学意义。（3）与同期实验组（UAC）相比,两个时间点的实验注射组（UAC+KN93）大鼠髁突软骨的全层厚度及软骨肥大层厚度明显增加,软骨中SO染色的阳性面积也显著增加;软骨中Ca MKⅡ和Ihh/Patched的m RNA及蛋白表达水平在两个时间点均显著下调;PTHr P的m RNA及蛋白的表达水平在8周时下调,在12周时上调;与软骨基质合成相关的基因Col2α1、Aggrecan和与增殖相关的基因Pcna的m RNA表达水平在两个时间点都显著上调;软骨中与软骨基质降解相关的基因Adamts5、MMP-13及与软骨细胞分化相关的基因Alp、Ocn的m RNA表达水平在8周时明显下调,而在12周时则没有明显变化。（4）两个时间点上,尽管注射KN93没有对髁突软骨中PPR的表达产生影响,但使得注射组髁突软骨中肥大浅层有钙盐沉积的软骨细胞的数量明显减少,衰老和凋亡的软骨细胞数量也显著减少。结论:1、UAC刺激可导致髁突软骨发生退行性变,表现为软骨细胞的分化活动加速、增殖相对下降,软骨细胞的凋亡增加、密度下降,软骨基质丢失,软骨的厚度变薄,同时伴有Ca MKⅡ和Ihh等与分化相关分子的表达水平上调,髁突软骨的退变随着UAC刺激的持续而加剧,退变髁突软骨中软骨细胞表达各相关分子的能力也下降。2、局部注射Ca MKⅡ的抑制剂KN93可通过抑制软骨细胞中Ca MKⅡ基因的转录及蛋白的活化,下调与软骨细胞分化及与软骨基质分解代谢相关分子的表达,并上调与增殖及软骨基质合成代谢相关分子的表达,从而增加UAC髁突软骨的厚度,改善由UAC刺激导致的髁突软骨退变。但这一治疗效果依赖于髁突软骨中存活软骨细胞的数量及状态,因此主要在软骨退变的早期发挥作用。3、KN93可降低对照组髁突软骨的全层厚度、软骨肥大层的厚度及钙化软骨层的厚度,并减少软骨基质染色的阳性面积,反映了其干预软骨细胞正常分化活动的毒副作用,提示Ca MKⅡ对正常软骨的维持是十分必要的。