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第一部分黑色素瘤干细胞系的建立、培养和鉴定目的:从黑色素瘤细胞（Melanoma parental cell）（MPC）中分离出具有干性且能稳定传代的黑色素瘤干细胞（Melanoma stem cell）（MSC）并进行干性的验证。方法:（1）将MPC细胞培养液中悬浮的细胞收集起来用含有10%FBS的DMEM高糖培养液再次培养,待细胞增殖到50%左右时收集培养液中的悬浮细胞再次进行传代培养,将“收集培养液中的悬浮细胞——将这些细胞继续培养后收取培养液中的悬浮细胞再进行传代培养”这一过程一共进行8次,然后将最后收集的悬浮细胞进行5次96孔板单克隆成球试验,筛选出成球能力强的细胞进行扩增培养。通过这样的方法得到的悬浮细胞即为MSC细胞。（2）检测MPC细胞和MSC细胞中干性基因oct4,sox2,klf4,aldh1,nanog的表达;（3）通过6孔板1000个细胞悬浮成球试验检测MSC细胞的干性;（4）通过96孔板单细胞克隆成球试验检测MSC细胞的干性;（5）通过裸鼠皮下成瘤试验检测MSC细胞皮下成瘤的能力,验证MSC细胞的干性。结果:（1）通过八次悬浮聚球法,成功分离出了黑色素瘤亲代细胞中的黑色素瘤干细胞。（2）在MSC细胞中,干性基因oct4,sox2,aldh1,klf4,nanog的表达量明显高于MPC细胞。（3）MSC细胞的6孔板1000细胞悬浮成球能力明显强于MPC细胞;（4）MSC细胞的96孔板单细胞克隆成球能力明显强于MPC细胞;（5）MSC细胞的裸鼠皮下成瘤能力明显强于MPC细胞。结论:通过八次悬浮聚球法筛选的黑色素瘤干细胞具有干性特征且能够连续传代保持稳定的干性,这为后续探索黑色素瘤干细胞的生物学特性及其对黑色素瘤转移的影响提供了良好的基础。第二部分黑色素瘤干细胞外泌体micro RNA-4535对黑色素瘤转移的影响目的:（1）探究黑色素瘤干细胞（MSC）及非干性黑色素瘤细胞（MPC）的培养液中是否存在外泌体。（2）探究MSC细胞的外泌体对MPC细胞的转移是否有影响。（3）探究MSC细胞外泌体中的micro RNA和MPC细胞外泌体中的micro RNA是否存在表达差异。（4）挖掘MSC细胞外泌体中相对于MPC细胞外泌体中高表达的micro RNA,并研究这些micro RNA对MPC细胞功能的影响。方法:（1）通过超速离心法提取MPC和MSC细胞培养液中的外泌体;通过WB检测外泌体蛋白marker,NTA检测外泌体粒径范围和粒子浓度,透射电镜检测外泌体结构和粒径这三种方法来鉴定提取的外泌体。（2）将MSC细胞的外泌体和MPC细胞共培养后检测MPC细胞在体外的迁移侵袭能力。（3）用慢病毒敲低MSC细胞的RAB27来构建稳定的MSC-sh-RAB27细胞系。（4）通过NTA检测MSC细胞敲低RAB27后细胞外泌体的粒子浓度的变化。（5）MSC-sh-RAB27细胞的外泌体和MPC细胞共培养后检测MPC细胞的迁移侵袭能力。（6）通过将MPC和MSC细胞外泌体进行micro RNA测序及分析来挖掘在MSC细胞外泌体中高表达的micro RNA。在MPC和MSC细胞及其外泌体中通过QPCR将通过测序分析得到的差异micro RNA再次进行筛选,得到在MSC细胞及其外泌体中稳定高表达的micro RNA,选择micro RNA-4535做深入的机制研究。（7）用micro RNA mimics在MPC细胞中过表达micro RNA-4535,然后进行迁移侵袭试验验证micro RNA-4535对MPC细胞转移的影响;用micro RNA inhibitor抑制MSC细胞中micro RNA-4535的表达,然后收集细胞外泌体和MPC细胞共培养后检测MPC细胞的迁移侵袭。（8）通过慢病毒构建稳定过表达micro RNA-4535的MPC-OE-mi R-4535细胞系,然后通过尾静脉注射MPC-OE-mi R-4535细胞到NOD/SCID小鼠体内检测过表达micro RNA-4535对转移定植能力低的MPC细胞在体内的转移能力的影响。（9）将MSC细胞的外泌体用PKH26标记,将MSC细胞中的micro RNA-4535用cy5标记,然后通过观察PKH26和cy5在MPC细胞中共定位的情况来检测MSC细胞的外泌体是否携带micro RNA-4535进入MPC细胞。（10）用micro RNA mimics在MSC细胞中过表达micro RNA-4535,然后收集细胞外泌体和MPC细胞进行共培养,然后检测MPC细胞中micro RNA-4535的表达量的变化和MPC细胞的迁移侵袭能力的改变。（11）用电穿孔转染法在MSC细胞的外泌体中直接转染micro RNA-4535 mimics,然后将这些外泌体和MPC细胞共培养,然后检测MPC细胞中micro RNA-4535的表达量的变化以及MPC细胞的迁移侵袭能力的变化。结果:（1）MPC和MSC细胞外泌体表达外泌体蛋白marker CD63,CD81,Alix;NTA结果显示提取的外泌体粒径峰值在100nm左右,粒径范围在公认的外泌体粒径范围内;透射电镜观测到外泌体具有双层膜结构,粒径大小在100nm左右。（2）MSC细胞的外泌体能够促进MPC细胞的迁移侵袭能力。（3）稳定敲低MSC细胞的RAB27后MSC细胞外泌体的分泌被抑制,5*10^7个MSC-sh-NC细胞和MSC-sh-RAB27细胞培养72小时后分泌的外泌体分别和MPC细胞共培养后,MSC-sh-RAB27细胞的外泌体丧失了促进MPC细胞迁移侵袭的能力。（4）MSC细胞外泌体中存在相对于MPC细胞外泌体中高表达的micro RNAs,其中差异倍数大于等于2,p值小于0.001的有:micro RNA-4535,micro RNA-1268a,micro RNA-93-3p,micro RNA-1246,micro RNA-3529-3p,micro RNA-592,micro RNA-4281。（5）MSC细胞外泌体中高表达的micro RNA-4535能够促进MPC细胞的迁移侵袭能力。（6）MSC细胞外泌体micro RNA-4535能够促进MPC细胞在小鼠体内的转移能力。（7）MSC细胞的外泌体和micro RNA-4535在MPC细胞中有共定位,表明MSC外泌体中的micro RNA-4535可以由外泌体转运到MPC细胞内。（8）MSC细胞过表达micro RNA-4535后分泌的外泌体和MPC细胞共培养后,MPC细胞中micro RNA-4535的表达量增高,MPC细胞的迁移侵袭能力增强。（9）抑制MSC细胞中micro RNA-4535的表达后,细胞分泌的外泌体中micro RNA-4535的含量降低,这些外泌体促进MPC细胞迁移侵袭的能力减弱。结论:MSC细胞外泌体中的micro RNA-4535可以被外泌体运输到MPC细胞中发挥促进黑色素瘤转移的功能。第三部分micro RNA-4535通过抑制黑色素瘤细胞的自噬从而促进肿瘤的转移目的:探究黑色素瘤干细胞外泌体micro RNA-4535促进黑色素瘤转移的机制。方法:（1）将micro RNA-4535的靶基因进行KEGG信号通路富集,筛选出micro RNA-4535可能作用的信号通路。（2）用micro RNA mimics在MPC细胞中过表达micro RNA-4535,然后通过WB检测细胞自噬标记蛋白P62,LC3I/II的表达;通过GFP-mcherry-LC3免疫荧光检测自噬流的变化;通过透射电镜检测自噬小体的变化。（3）用micro RNA mimics在MPC细胞中过表达micro RNA-4535,然后再用雷帕霉素（Ra Pa）诱导MPC细胞的自噬,然后检测细胞自噬流的变化和细胞的迁移侵袭能力的变化。（4）通过生物信息学分析筛选和自噬相关的micro RNA-4535可能的靶基因。（5）通过QPCR验证筛选的靶基因的表达是否受到micro RNA-4535的影响。（6）通过双荧光素酶试验验证筛选的靶基因是否是micro RNA-4535的直接靶基因。结果:（1）micro RNA-4535的靶基因在自噬这一通路上富集的最多,因此选择该通路做后续的实验验证。（2）当MPC细胞过表达micro RNA-4535后,细胞的自噬蛋白P62的表达量增高,LC3I和LC3II的表达量增高,自噬斑块堆积,透射电镜显示细胞的自噬小体堆积。（3）MPC细胞过表达micro RNA-4535后再用Ra Pa诱导细胞自噬,细胞的迁移侵袭能力增强。（4）经实验和分析发现,在MPC细胞中,ATG13的表达受到micro RNA-4535的抑制明显,ATG13与micro RNA-4535结合的可能性也较高,所以ATG13是micro RNA-4535潜在的靶基因。但是双荧光素酶试验结果显示ATG13和micro RNA-4535没有直接结合。结论:MSC细胞外泌体micro RNA-4535通过抑制MPC细胞的自噬从而促进黑色素瘤的转移,但是ATG13并不是micro RNA-4535的直接靶基因,micro RNA-4535对自噬的调控机制还需进一步探索。