头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤,患者5年总生存率约为40-50%[1]。尽管近年来临床治疗水平不断提高,但局部晚期及复发转移性头颈部鳞癌患者的预后仍然很差。尤其是复发转移性头颈部鳞癌患者,5年生存率甚至不足5%[2,3]。如何提高复发转移性头颈部鳞癌患者的生存率,成为了目前研究的热点及难点问题。PD-1/PD-L1阻断疗法是近几年肿瘤免疫治疗中最显著的进展之一,通过阻断肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）如T细胞上PD-1与肿瘤细胞上PD-L1的结合,重新激活了 T细胞抗肿瘤功能,达到了治疗作用。目前该阻断疗法已应用于黑色素瘤和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的临床治疗中。在复发转移性头颈鳞癌患者中,PD-1/PD-L1阻断疗法也已初步显示出令人鼓舞的效果[4,5],但总缓解率差强人意,在初期临床试验中仅为13%-18%[6,7],究其原因尚不清楚。因此探讨PD-L1在头颈鳞癌中的作用,研究其调节机制,对制定治疗方案,提高头颈鳞癌患者的生存率有着重要的意义。在肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中,肿瘤细胞可表达PD-L1[8],且其表达与多种恶性肿瘤患者的临床预后呈负相关[9],但该结论尚存争议[10,11]。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是存在于肿瘤微环境内的免疫细胞,主要为T淋巴细胞。它们在肿瘤组织中发挥着抗原特异性宿主免疫反应的重要作用[12]。既往的研究中已经肯定了肿瘤微环境中CD8+TILs在头颈肿瘤免疫治疗中的正面作用[13-15],而CD3+和CD4+TILs的研究数据相对较少。所以关于PD-L1以及特定TILs亚群（CD3+和CD4+）在头颈鳞癌中的表达及其对疾病预后的作用,仍然需要更多的研究去阐明。目前,肿瘤细胞表达PD-L1的机制尚不清楚,研究发现这可能与非编码RNA的表达紊乱[16,17]以及肿瘤微环境中干扰素γ的调节作用有关[18,19]。非编码RNA是一组基因转录过程中的产物,可广泛调节机体生理或病理过程。目前研究最多的非编码RNA包括微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）及环状RNA（circRNA）。miRNA可与其靶基因的mRNA 3’UTR区域结合,通过降解mRNA抑制其翻译,在转录水平上调控基因的表达[20]。circRNA是一种3’和5’端以共价键连接的闭合环状内源性非编码RNA,其可作为竞争性内源性RNA（ceRNA）与miRNA特异性结合,进而抑制miRNA的功能,从而间接调控靶基因的表达[21]。近年来随着研究的深入,发现非编码RNA在人类癌症发生及肿瘤转移中起着重要而复杂的作用[22]。而miRNA及circRNA可作为免疫检查点分子的调节剂,有望成为潜在的生物标记物和治疗靶点[23-25]。干扰素γ（IFNγ）作为介导细胞免疫反应的关键调节剂,它不仅可以促进免疫调节,还具有抗病毒和抗癌活性[26]。然而最近的研究发现IFN-γ在肿瘤的免疫逃逸过程中还具有致瘤性的作用。在黑色素瘤及胶质瘤中的研究中显示干扰素γ可上调PD-L1的表达[18,27],进而促进了肿瘤细胞的免疫抵抗及免疫逃逸。在头颈鳞癌中关于干扰素γ与PD-L1的关系研究较少,故仍需进一步明确。本研究以PD-L1为切入点,首先在头颈鳞癌的组织样本中检测PD-L1及TILs（CD3+、CD4+）的表达情况,并分析其与患者预后的相关性。然后在细胞实验中转染小干扰RNA（siRNA）,检测沉默PD-L1对头颈鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力、细胞凋亡及集落形成能力的影响。从临床和细胞水平上分别阐明PD-L1在头颈鳞癌疾病进程中的重要作用。其次,应用干扰素γ（IFN-γ）刺激头颈鳞癌细胞,明确IFN-γ通过JAK/STAT信号转导通路对PD-L1表达的调控作用。并在机制研究中应用生物信息分析技术,预测并鉴定特异靶向PD-L1的miRNA及circRNA,通过qRT-PCR,Western Blot,双荧光素酶报告基因实验等验证miR-382-3p对PD-L1和circ-0000052对miR-382-3p的直接靶向作用,阐述三者间的调节关系。从不同角度,为PD1/PD-L1免疫治疗提供新靶点和依据。本研究将从四个章节进行阐述和论证:第一章、PD-L1及肿瘤浸润淋巴细胞在头颈鳞癌组织中的表达及其与疾病预后相关性的研究研究目的:探讨PD-L1、CD3及CD4在头颈鳞癌中的表达水平及与病人预后的相关性。研究方法:1.收集喉及下咽癌样本,应用免疫组化方法检测PD-L1、CD3及CD4的表达。提取样本中的RNA,应用qRT-PCR定量检测PD-L1表达。2.统计分析PD-L1、CD3、CD4表达水平与头颈鳞癌患者预后的相关性。研究结果:1.免疫组化显示PD-L1在86.0%的头颈鳞癌样本中评分≥1,近一半的样本中（45.2%）呈高表达（评分＞5）。2.免疫组化显示CD3和CD4在100%的样本中表达,且CD3在肿瘤组织中较CD4的表达更高。3.qRT-PCR显示在81.7%的样本中检测到PD-L1 mRNA的表达,并与PD-L1蛋白表达呈正相关。4.高表达PD-L1的患者与低表达的患者相比,总生存期和无病生存期明显缩短。肿瘤浸润淋巴细胞中高表达CD4的患者与低表达的患者相比,总生存期和无病生存期明显延长。而CD3的表达情况与临床预后无相关性。5.单因素及多因素分析显示年龄、肿瘤分化程度、PD-L1表达情况、CD4表达情况显著影响了患者的总生存期及无病生存期。6.PD-L1的表达水平仅与患者的年龄有关,而与其他临床病理特征无显著相关性。研究结论:1.PD-L1在大部分头颈鳞癌组织中表达,高表达的PD-L1与总生存期和无病生存期的延长呈负相关。2.CD3+及CD4+T淋巴细胞存在于头颈鳞癌肿瘤微环境中,且CD3表达量较CD4更高。3.肿瘤浸润淋巴细胞中高表达的CD4与总生存期和无病生存期的延长呈正相关。第二章、沉默PD-L1对头颈鳞癌细胞的抑瘤作用的研究研究目的:探讨沉默PD-L1对头颈鳞癌细胞系（FaDu,SCC-9）增殖、迁移、侵袭能力和凋亡的影响。研究方法:1.通过qRT-PCR筛选PD-L1高表达的头颈鳞癌细胞系。2.通过脂质体转染siRNA,构建沉默PD-L1细胞系。3.应用qRT-PCR及Western Blot检测沉默PD-L1细胞系的mRNA及蛋白表达水平。4.应用MTS法、Transwell小室及基质胶、Caspase 3活性检测等方法检测沉默PD-L1后对FaDu、SCC-9细胞增殖、迁移及侵袭能力和凋亡的影响。研究结果:1.qRT-PCR显示FaDu及SCC-9细胞与正常口腔上皮细胞系相比,PD-L1的表达水平显著上调。2.沉默PD-L1后,qRT-PCR及Western Blot检测结果表明FaDu及SCC-9细胞中PD-L1的表达水平显著下降。3.沉默PD-L1后,MTS检测结果显示FaDu及SCC-9细胞的增殖活性下降,尤其是48小时的增殖活性下降最明显。4.沉默PD-L1后,Transwell迁移及侵袭实验显示FaDu及SCC-9细胞的迁移能力及侵袭能力均明显下降。5.沉默PD-L1后,FaDu及SCC-9细胞中Caspase-3酶活性增高。研究结论:1.PD-L1在两种头颈鳞癌细胞系（FaDu,SCC-9）中呈高表达。2.应用脂质体转染siRNA可有效沉默肿瘤细胞中PD-L1的表达。3.沉默PD-L1后可抑制头颈鳞癌细胞系的增殖、降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,诱导肿瘤细胞凋亡。第三章、miRNA对PD-L1的调控机制以及干扰素γ调控PD-L1表达的传导通路的研究研究目的:探讨miRNA对PD-L1表达的调节作用,阐明miRNA与PD-L1的靶向关系;以及验证干扰素γ在头颈鳞癌细胞系中通过JAK/STAT信号传导通路对PD-L1表达的调控作用。研究方法:1.应用生物信息靶基因预测软件寻找靶向调控PD-L1的潜在miRNAs,通过qRT-PCR方法检测它们在头颈鳞癌细胞系的表达水平。2.在 FaDu 及 SCC-9 细胞中分别转染 pre miR-375-5p 及 pre miR-382-3p,qRT-PCR检测miRNA验证转染效率,应用qRT-PCR及Western Blot检测上调miRNAs后对PD-L1表达水平的影响。3.构建PD-L1 3’UTR野生型及突变型重组质粒,通过双荧光素酶基因报告实验验证miR-375-5p及miR-382-3p与PD-L1的直接靶向作用。4.通过平板克隆实验观察转染PD-L1-siRNA、pre miR-382-3p及anti miR-382-3p对细胞的集落形成能力的影响。5.FaDu及SCC-9细胞在IFN-γ作用后,应用qRT-PCR检测JAK/STAT信号通路中相关因子的表达量,Western Blot检测PD-L1蛋白的表达水平。并通过rescue实验,沉默STAT1,给予细胞IFN-γ刺激后观察PD-L1的变化。研究结果:1.通过生物信息学靶基因预测软件找到5种潜在的可能靶向PD-L1的肿瘤抑制型 miRNAs,分别是:miR-34c-5p、miR-23a-3p、miR-197-5p、miR-375-5p、miR-382-3p。应用qRT-PCR在FaDu和SCC-9细胞检测上述miRNAs的表达情况。结果显示,miR-375-5p及miR-382-3p在FaDu和SCC-9细胞中的表达量明显低于正常对照NOE细胞的表达量,最终选定miR-375-5p及miR-382-3p进行下一步实验。2.qRT-PCR检测结果表明FaDu和SCC-9细胞在转染pre miRNAs后miR-375-5p及miR-382-3p表达量明显增加,说明转染成功。转染后PD-L1的表达均下调,其中转染miR-382-3p后PD-L1的表达下调具有显著性差异。3.miR-375-5p及miR-382-3p与PD-L1 3’UTR的双荧光素酶报告实验结果显示,转染了 pre miR-382-3p的细胞能够与野生型PD-L1 3’UTR上的结合位点结合,其荧光素酶的活性值明显下降。而转染premiR-375-5p与野生型PD-L1 3’UTR重组质粒的细胞,其荧光素酶活性与空白质粒的细胞活性相近,无统计学差异。4.Western Blot 结果显示 siRNA 沉默 PD-L1 及转染 pre miR-382-3p 后 PD-L1蛋白表达水平明显下降。而转染了 miR-382-3p拮抗剂的细胞,PD-L1的表达无明显变化。5.平板克隆实验结果显示siRNA沉默PD-L1组及pre miR-382-3p组的细胞的集落形成率与对照组相比显著下降。6.在干扰素γ对PD-L1表达的调控作用实验中,qRT-PCR结果显示FaDu及SCC-9细胞在IFN-γ作用后JAK2、STAT1及PD-L1的表达量显著上调。Western Blot结果显示FaDu及SCC-9细胞在IFN-γ作用后PD-L1蛋白的表达水平明显增加。沉默STAT1后,实验组（IFN-γ+siRNA STAT1）PD-L1的表达量较单纯给予IFN-γ刺激的FaDu的PD-L1表达量明显降低。研究结论:1.miR-382-3p在头颈鳞癌细胞系（FaDu,SCC-9）中低表达。2.miR-382-3p对PD-L1具有直接的靶向调节作用。头颈鳞癌细胞中低表达的miR-382-3p解除了对PD-L1的靶向抑制作用,造成了 PD-L1的过表达。3.沉默PD-L1或上调miR-382-3p可抑制头颈鳞癌细胞系的集落形成。4.干扰素γ可通过IFNGR/JAK/STAT信号传导通路诱导头颈鳞癌细胞上调PD-L1的表达。第四章、CircRNA/miRNA/PD-L1分子轴在头颈鳞癌中调控机制的研究研究目的:研究 circRNA-0000052 通过 miRNA-382-3p对PD-L1 的调控机制。研究方法:1.应用circRNA数据库寻找靶向调控miRNA-382-3p的潜在circRNA。2.应用qRT-PCR检测circ-0000052在头颈鳞癌细胞系中的表达水平及应用RNase R及放线菌素D处理验证circ-0000052的稳定性。3.在 FaDu 细胞中分别转染 pre miR-382-3p 及 miR-NC,qRT-PCR检测FaDu细胞中的circ-0000052、miR-382-3p及PD-L1的表达水平。4.构建circ-0000052 3’UTR野生型及突变型重组质粒,通过双荧光素酶基因报告实验验证miR-382-3p与circ-0000052的直接靶向作用。5.分别应用 premiR-382-3p、靶向 circ-0000052 的 siRNA（si-circ-0000052）以及 si-circ-0000052 和 anti miR-382-3p 共转染 FaDu 细胞,应用 Western Blot检测细胞PD-L1蛋白的表达水平,探讨三者之间的调控作用。研究结果:1.通过头颈部鳞癌KEGG途径的功能分析,结合circRNA生物特性,选择circ-0000052作为候选circRNA进行功能研究。2.qRT-PCR结果显示circ-0000052在FaDu、SCC-9表达量较NOE细胞系显著增高,其中FaDu细胞系中的表达水平最高。经RNaseR处理后,PCR结果显示环状的circ-0000052表达量与未处理组比无明显改变。经放线菌素D处理后,显示环状的circ-0000052较其线性序列AGO1的mRNA具有更强的稳定性。3.在 FaDu 细胞中转染 pre miR-382-3p,qRT-PCR 结果显示 miR-382-3p 大幅增高,PD-L1表达下降,而circ-0000052表达量无明显变化。4.双荧光素酶基因报告实验结果显示,转染了 pre miR-382-3p及circ-0000052 野生型质粒实验组的荧光素酶活性显著降低。5.Western Blot 结果显示单独转染 pre miR-382-3p 或 si-circ-0000052 均可降低PD-L1的表达,而同时转入si-circ-0000052和anti miR-382-3p,与单独转染si-circ相比,PD-L1蛋白表达增加。研究结论:1.circ-0000052在头颈鳞癌细胞系（FaDu,SCC-9）中高表达。2.circ-0000052对miR-382-3p具有直接靶向下调作用。3.头颈鳞癌细胞中上调表达的circ-0000052可通过对miR-382的直接靶向海绵吸附作用,降低miR-382的表达水平,进而解除了对PD-L1表达抑制,造成PD-L1上调。