论文部分内容阅读
本实验室之前已筛选分离得到一株米曲霉gif-10,并且从中克隆得到了p-葡萄糖苷酶的基因组序列,为了让p-葡萄糖苷酶的酶活力以及酶学性质得到提高,以及为以后纤维素酶共表达提供基础平台,本研究要构建p-葡萄糖苷酶的酵母工程菌。通过实验得到如下结果：1、通过TRIZOL法提取了米曲霉gif-10的总RNA,并以它为模板,扩增得到了p-葡萄糖苷酶的cDNA序列,该cDNA序列长度为2586 bp,其中GC含量为54.4%,AT含量为45.6%,编码861个氨基酸,其中前20个氨基酸编码信号肽。通过序列比对分析发现,β-葡萄糖苷酶基因bgl与Aspergillus oryzae RIB40的β-葡萄糖苷酶基因序列的同源性为99%。2、引入酶切位点Sac Ⅱ和Xba Ⅰ,将带有酶切位点的目的基因片段与质粒pPICZaA连接,转化,并进行序列测定。序列测定正确后电转入酵母X33,并对酵母转化子进行筛选、鉴定,挑选出6个酵母转化子,酶活力分别为5.95、6.10、5.77、6.88、6.22、5.99。选取4号酵母工程菌进行后续实验,并命名为pPICZaA-bgl。3、将得到酵母工程菌进行培养诱导,最佳诱导时间为96h,连续10次连续培养诱导酵母工程菌,其生长密度以及p-葡萄糖苷酶酶活性方面基本保持稳定,有很好的遗传稳定性。4、通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化,SDS-PAGE检测有大小约100 KD的单一蛋白条带,而β-葡萄糖苷酶蛋白大小理论值为94 KD,因为其具有14个潜在糖基化位点,所以大小正确,得到了纯化的β-葡萄糖苷酶蛋白。纯化后的p-葡萄糖苷酶酶活为17.19U/mL,蛋白含量0.286 mg/mL；比活为6Q.10 U/mg。5、对p-葡萄糖苷酶酶学性质分析得知,它的最适温度为50℃,在20～50℃的环境中,酶活力稳定性好；最适pH为5.0,在环境pH为4.0～6.0时,其酶活力能够维持较高水平。通过底物特异性分析,β-葡萄糖苷酶对于水杨苷和纤维二糖的底物特异性强；金属离子对其酶活影响的实验结果显示,激活作用最明显的为MnCl2,抑制作用最明显的为CuCl2。