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脂肪酶是一类水解油脂的酶类,可催化甘油三酯水解生成甘油及长链脂肪酸。脂肪酶除了有水解活性以外,还具有酯化、转酯等活性。因此,脂肪酶在食品加工、制药、生物柴油合成、去污剂等诸多工业领域具有很广泛的应用。尤其是嗜热脂肪酶能够充分满足工业上的苛刻要求,因此嗜热脂肪酶已成为脂肪酶研究的新热点,具有重要的意义。本文以实验室保存的脂肪酶活性较高的嗜热真菌Neosartorya fischeri P1为研究对象。该菌在45℃培养24 h可快速生长,分泌大量脂肪酶,并迅速降解培养基中的橄榄油至清澈透亮。通过同源克隆,获得了该菌的7个完整的脂肪酶基因。去除自身信号肽后,7个脂肪酶基因成熟蛋白编码区分别重组到pET-22b(+)载体上,在大肠杆菌中进行表达。经IPTG诱导后,7个脂肪酶基因均能在大肠杆菌中进行表达,但是酶活力并不高。除原核表达脂肪酶外,本文也进行了酵母表达。上述的7个脂肪酶基因进一步克隆到表达载体pPIC9中,并重组到Pichia pastoris GS115中进行真核表达。结果表明仅有两个脂肪酶基因Lip24和Lip09在P. pastoris中能够成功表达。Lip09基因表达水平较高,在摇瓶水平上其产量能达到2 g/L发酵液。经3.7 L发酵罐发酵和甲醇诱导96 h后,重组脂肪酶Lip24和Lip09的活力分别为4.2 U/mL和1900 U/mL。酶学性质研究表明纯化的Lip24和Lip09具有良好的嗜热性和嗜酸性。Lip09的最适pH为5.0,在较宽的pH范围内(pH 3.5-8.0)具有较高的活性,甚至在pH 2.0仍有40%左右的酶活力。Lip09的最适温度为60℃,当温度上升到70℃,酶活力仍能够保持37%左右,且在50-65℃保持80%以上的酶活力。Lip09的热稳定性良好,在50℃处N30 min,残余酶活力在95%以上；在55℃处N30 min,剩余酶活力仍有51%左右。Lip24的最适pH为7.0,最适温度为50℃,具有宽泛的pH稳定性。在pH 3.0-7.0保温1 h,酶活力都保持在95%以上；即使在pH 2.0的条件下温育1 h,残余的酶活力仍能保持40%以上。本研究通过基因克隆和异源表达的方法获得了一个嗜酸、嗜热且高酶活的重组脂肪酶,不仅为研究脂肪酶的嗜酸、嗜热机制提供了良好的材料,也为实际应用提供了一个优良的候补工业酶。