Odorrana schmackeri HSH皮肤抗菌肽分子克隆、表达及结构与功能研究

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抗菌肽AMPs通常是指小于100个氨基酸残基具有抗菌活性的多肽,同时具有富含疏水和带正电荷氨基酸残基的特点。抗菌肽由于其种类、结构和作用机制的多样性,使得微生物难以对其产生抗性。因此新的抗菌肽的发现、结构改造及生产工艺的改善成为未来抗菌药物开发的重要发展方向。两栖动物皮肤分泌液是抗菌肽资源的一大宝库,人们在臭蛙属中发现了种类众多的抗菌肽家族。花臭蛙Odorrana schmackeri属于蛙科Ranidae,臭蛙属Odorrana,在我国黄河以南地区分布十分广泛。本实验以黄山花臭蛙种群Odorrana schmackeri HSH皮肤为材料,研究其抗菌肽cDNA分子多样性,并对部分抗菌肽分子通过原核表达及化学合成进行生物活性功能研究。取得以下研究结果:1、通过Odorrana schmackeri HSH皮肤RNA的提取、反转录以及特异性引物扩增得到21条cDNA序列,编码11种抗菌肽,分属4个抗菌肽家族。其中7个为新发现的抗菌肽:Odorranain-1hSc、Odorranain-2hSc、Esculentin-hSc、Nigrosin-hSc、 Brevinin-1hS、Brevinin-2hSc、Brevinin-3hSc、2、采用了原核表达及分离纯化获得重组Odorranain-1hSc并进行了活性检测。抑菌试验表明其具有较强的白色念珠菌(Candida albicans)抑制活性,最小抑菌浓度为25μg.ml-1。质谱检测其相对分子质量约为1772 Da。与Odorranain-1hSc分子式计算得到的结果一致。3、通过化学合成Brevinin-1hSc并进行活性试验。Brevinin-1hSc表现出广谱的抗菌活性,对革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus和Bacillus subtilis、革兰氏阴性菌Escherichia coli和真菌Candida albicans均显示较强的抑菌活性,最小抑菌浓度分别为1.56μg.ml-1,25μg.ml-1、12.5μg.ml-1和12.5μg.ml-1.在杀菌动力学试验中,Brevinin-1hSc在浓度为625μg.ml-1时,30min能够全部杀死金黄色葡萄球菌。通过电子显微镜观察Brevinin-1hSc处理后的金黄色葡萄球菌,发现其细胞壁上有囊泡状突起,细胞拟核区域弥散,细胞内部出现褶皱状结构。
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