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研究背景溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因不明的反复发作的慢性非特异性结肠炎症，为消化系统疾病中常见的难治性疾病。近年来，UC在我国的发病率呈快速增长趋势，越来越引起人们重视。目前，UC的治疗措施主要为抗炎抗免疫，例如糖皮质激素、免疫抑制剂、非甾体抗炎药的应用等，但临床治疗效果并不满意，且长期应用副作用严重。因此，急需寻找疗效良好、副作用较小的治疗方法。唐古特大黄为传统的胃肠道用药，临床上长期用于胃肠道疾病的治疗，疗效显著。本实验室前期分离纯化获得了唐古特大黄多糖(Rheum tanguticum polysaccharide， RTP)，发现RTP对大鼠溃疡性结肠炎疗效显著。为了深入研究RTP的作用机制，本课题从前期实验分离纯化得到的RTP中再分离得到了分子量较低的组分RTP-2，经过糖含量和仪器分析发现该组分为含有蒽醌的多糖复合物。为了进一步探讨RTP-2的生物活性，本课题采用酶解的方法，对RTP-2作进一步的酶降解分离纯化得到新的不含蒽醌的大黄多糖片段RTP-2A。然后，采用TNBS诱导的大鼠UC模型，将二者对溃疡性结肠炎治疗作用及其对肠道菌群失调的调节作用进行对照研究；并在细胞水平深入研究RTP-2、RTP-2A和大黄素(Emodin)对LPS致炎的巨噬细胞分泌的细胞因子的影响，以及RTP-2、RTP-2A与巨噬细胞甘露糖受体的结合特性。本课题旨在通过上述研究探讨含有蒽醌的RTP-2与其酶解后不含有蒽醌的多糖片段RTP-2A，在UC治疗、肠道菌群失调和免疫功能方面调节作用的差异，以期进一步探讨大黄多糖对结肠炎的治疗机制，为UC的治疗以及多糖药物研究提供新的线索。实验方法第一部分：RTP-2的酶解、分离和纯化：采用β-甘露聚糖酶酶解RTP-2，RTP-2为100~200KD且含有蒽醌的多糖复合物，本实验通过正交实验筛选最佳酶解工艺，以Sephadex G-100凝胶柱分离、纯化酶解得到的多糖片段，并通过HPLC检测纯化后多糖片段中蒽醌的含量。第二部分：观察RTP-2及RTP-2A对TNBS诱导大鼠试验性结肠炎的治疗作用：采用40%乙醇和TNBS混悬后给大鼠灌肠复制模型，动物分组为：正常对照组(normal)和模型组(TNBS)给0.2ml/day生理盐水，RTP-2治疗组(RTP-2)200mg/kg/day，RTP-2A治疗组(RTP-2A)200mg/kg/day和DEX阳性对照组(DEX)0.2mg/kg/day；每组10只，造模后6h灌胃给药，连续给药5天，每天1次，治疗结束后，大鼠禁食不禁水24h，乙醚麻醉处死动物，解剖收集肛门以上约8cm结肠，用于疾病活动指数、溃疡指数及病理学检测及评分；比较RTP-2、RTP-2A与DEX对UC的疗效。第三部分：临床UC患者粪便菌群及UC大鼠肠道菌群分析：采集临床确诊为UC且近四周未服用抗菌药物的患者的新鲜粪便（65例），参考《肠道菌群粪便涂片检查图谱》进行肠道菌群失调的分度诊断。结肠炎大鼠分组同第二部分为：正常对照组(normal)、模型组(TNBS) RTP-2治疗组，RTP-2A治疗组和Emodin阳性药对照组(Emodin)20mg/kg/day。TNBS复制模型，给药5天后，乙醚麻醉处死，在无菌操作台取盲肠段大鼠粪便，涂片检查肠道菌群失调的分度；通过实时定量PCR技术定量分析上述各UC大鼠盲肠粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌、脆弱拟杆菌及肠球菌的变化情况，比较RTP-2、RTP-2A与Emodin对UC大鼠菌群失调的调节作用。第四部分：观察RTP-2及RTP-2A对LPS诱导炎症因子分泌的拮抗作用：以巨噬细胞系RAW264.7作为研究对象，Man-FITC-BSA为配体，通过竞争性抑制试验，以荧光显微镜和多功能酶标仪定性、定量的观察巨噬细胞荧光染色情况，比较RTP-2、RTP-2A及MR单抗与RAW264.7中MR的结合能力的差异；然后，通过ELISA和Western blot的方法观察RTP-2及RTP-2A对LPS诱导RAW264.7分泌的细胞因子TNF-α及NO的影响，并对其可能的信号通路进行研究。实验结果1．通过β-甘露聚糖酶对RTP-2的酶解、分离和纯化，获得分子量分别为7000-11000、20000-35000、2000-3000的多糖片段RTP-2A，RTP-2B和RTP-2C，其中RTP-2A量最多，且未检测到蒽醌，其甘露糖含量为41.36%。2．RTP-2、RTP-2A对TNBS诱导的大鼠试验性结肠炎疗效显著，RTP-2、RTP-2A和DEX对UC大鼠疾病活动指数没有差异(P＞0.05)，对于大体形态评分和组织学评分的作用：RTP-2＞RTP-2A＞DEX(P<0.05)，病理结果显示：RTP-2及RTP-2A可显著促进黏膜上皮的修复和再生，其病理评分为：RTP-2＞RTP-2A＞DEX(P<0.05)，含有蒽醌的RTP-2的抗炎作用优于不含蒽醌的RTP-2A。3.65例UC患者中45例(69.3％)发生菌群失调，而TNBS诱导的UC大鼠均发生菌群失调，较UC患者的菌群失调分度更为严重。实时定量PCR结果提示，UC大鼠肠道益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌明显减少，而条件致病菌脆弱拟杆菌和肠球菌过度增殖。RTP-2及RTP-2A均可逆转该菌群失调，使肠道菌群恢复平衡，且含有蒽醌的RTP-2效果更优，其对脆弱拟杆菌及肠球菌抑制作用优于RTP-2A组(P<0.05)。Emodin治疗组大鼠肠道双歧杆菌和乳酸杆菌未见明显变化，而对脆弱拟杆菌、肠球菌有抑制作用，与TNBS组大鼠相比有显著性差异(P<0.05)，但Emodin对双歧杆菌和乳酸杆菌促增殖的作用不及RTP-2与RTP-2A(P<0.05)。4. RTP-2及RTP-2A与MR具有一定的亲和力，亲和力强弱为：MRmAb＞RTP-2A＞RTP-2。RTP-2、RTP-2A及Emodin均可拮抗LPS诱导巨噬细胞TNF-α及NO的分泌，拮抗LPS诱导的磷酸化p65蛋白表达的上调；该作用可被MR单抗阻断；但RTP-2的作用弱于RTP-2A(P<0.05)。结论1.在本实验室前期研究的基础上，将RTP进一步分离纯化得到分子量较低的组分RTP-2，经糖含量与仪器分析发现该组分为含有蒽醌的多糖复合物；为了探讨蒽醌对低分子量大黄多糖作用的影响，再将RTP-2进行酶解、分离和纯化，获得不含有蒽醌的RTP-2A；二者均为新的大黄多糖片段，未见文献报道。2. RTP-2、RTP-2A及DEX对大鼠UC具有良好的治疗作用，RTP-2与RTP-2A主要通过对结肠粘膜异常免疫反应的调节和促进粘膜的修复、再生来治疗UC，而DEX对UC的治疗作用主要体现在炎症抑制上。RTP-2、RTP-2A抑制炎症反应的作用，可能与其抑制NF-κB的活化，降低TNF-α的分泌有关。3. TNBS诱导的UC大鼠较临床UC患者肠道菌群紊乱更加严重。RTP-2及RTP-2A均可逆转TNBS诱导的UC大鼠的菌群失调，促进乳酸杆菌和双歧杆菌增殖，抑制脆弱拟杆菌及肠球菌增殖；而Emodin治疗组仅对脆弱拟杆菌和肠球菌有一定的抑制作用，对乳酸杆菌和双歧杆菌没有影响。提示RTP-2致病菌的抑制作用上优于RTP-2A可能与其含有蒽醌有关。4. RTP-2和RTP-2A可通过MR的介导被巨噬细胞内吞入胞，通过降低P-p65的表达水平，抑制NF-κB p65的活化，从而拮抗LPS诱导的巨噬细胞产生的TNF-α和NO。