颅骨缺损是颅颌面外科及整形外科面临的常见问题，其形成原因有脑外伤、颅内肿瘤及脑血管意外手术等。大面积颅骨缺损的患者容易罹患一系列神经症状，如头痛、眩晕、易激惹、记忆力下降、抑郁等，临床上称之为颅骨缺损综合征，严重影响患者的生活质量。并且，失去颅骨保护的脑组织易于受到外力的伤害，缺损颅骨还会给患者带来严重的美观问题。因此，如何修复缺损的颅骨成为临床工作者必需解决的一个重要问题。传统的治疗颅骨缺损方法包括自体骨及同种异体骨移植等，存在明显的缺陷。组织工程骨技术的发展为颅骨缺损修复提供了新的思路。组织工程骨的概念包括了种子细胞、支架材料和细胞因子三要素。其中，遴选优秀的种子细胞是构建组织工程骨的前提和基础。骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSC）是目前应用最为广泛的种子细胞，其成骨能力在一系列体外及体内实验研究中已得到证实。但是，BM-MSC也存在一些缺点，尤其是促进新血管发生的作用不明显，不利于修复大面积的骨缺损。外周血CD34+（PB-CD34+）细胞是包含造血干细胞（HSC）和内皮祖细胞（EPC）等细胞成分的混合细胞群。近年来，PB-CD34+促进新生血管发生的作用已被多个实验所证实。并且，PB-CD34+细胞还可以向成骨细胞分化并促进新骨的形成。因此我们推测，可否将PB-CD34+细胞与BM-MSC进行共培养，构建以PB-CD34+细胞为辅助细胞，BM-MSC为目的细胞的共培养体系？共培养所得细胞的生物学特性，尤其是体外及体内成骨能力如何？共培养细胞能否做为一种新的种子细胞应用于临床？为了回答这些问题，本研究首先建立PB-CD34+细胞与BM-MSC共培养体系，并通过一系列的体外、体内实验验证共培养细胞能否做为一种新型的种子细胞用于组织工程骨的构建。研究目的1.分离PB-CD34+细胞及BM-MSC，建立以PB-CD34+细胞为辅助细胞，BM-MSC为目的细胞的共培养体系。2.探讨共培养细胞的生物学特性，尤其是体外及体内成骨能力，并将共培养细胞与单纯BM-MSC的成骨能力做一对比。3.应用共培养细胞膜片复合羟基磷灰石（HA）支架材料修复兔颅骨极限缺损模型，探讨共培养细胞的临床应用前景。研究方法1.应用流式细胞仪分选兔PB-CD34+细胞；应用密度梯度离心结合贴壁培养法分离BM-MSC，并利用流式细胞技术检测所得细胞的表面分子表达，克隆集落形成、MTT法检测细胞增殖，并进行成骨、成脂及成神经诱导，从而鉴定所得细胞为BM-MSC；最后以直接接触方式对PB-CD34+细胞及BM-MSC进行共培养，建立共培养体系，并检测共培养细胞的构成。2.对共培养细胞的生物学特性进行分析：检测细胞周期及凋亡，检测细胞体外成骨能力，对细胞进行成膜诱导，将细胞膜片复合HA进行裸鼠体内移植，检测细胞体内成骨能力，以上检测项目均设计与单纯BM-MSC进行比较、对照。3.建立兔颅骨极限缺损模型。分别利用共培养细胞及单纯BM-MSC细胞膜片复合HA进行修复。术后8周处死动物，分别通过影像学、组织学及分子生物学检测手段比较两种方法的修复效果。实验结果1.应用流式细胞仪分选可以得到PB-CD34+细胞，分选率为0.8%。分离所得的BM-MSC，以流式细胞仪鉴定其高表达间充质干细胞标志物，不表达造血系干细胞标志物；通过克隆形成实验及MTT法检测细胞增殖能力，证实分离细胞具有自我更新能力；通过成骨、成脂及成神经分化实验，证实了分离细胞具有多向分化能力。共培养体系建立，该体系中既包括大量的BM-MSC，也包括贴壁生长的PB-CD34+细胞。2.将共培养细胞的生物学特性与单纯BM-MSC相比较：流式细胞仪检测细胞周期及凋亡发现，共培养细胞具有更高的增殖能力和相对少的早期凋亡率；体外及体内成骨能力检测发现，共培养细胞的成骨能力更强。3.移植共培养细胞及单纯BM-MSC细胞膜片复合HA修复兔颅骨极限缺损模型发现：活体常规CT及术后所取颅骨标本micro-CT扫描显示，共培养细胞组实验动物的修复效果较好；组织学检测及定量分析显示，共培养细胞组新生的骨小梁体积及新生骨修复缺损比率均高于单纯BM-MSC组；实时定量PCR及Westernblot检测发现，共培养细胞组缺损修复区成骨及促血管生成相关因子的表达量高于单纯BM-MSC组。结论1.通过将PB-CD34+细胞与BM-MSC以直接接触方式共培养，可以建立一种特殊的共培养细胞体系。2.共培养细胞具有比单纯BM-MSC更强的体外及体内成骨能力。3.应用共培养细胞修复兔颅骨极限缺损模型的效果优于单纯BM-MSC，共培养细胞有很好的临床应用前景。