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临床上由于炎症、颌面部先天畸形、外伤与肿瘤等原因导致的骨缺损不仅影响咀嚼、发音、进食等功能,而且影响患者身心健康和生活质量,如何对骨组织的缺损进行修复是目前亟需解决的问题。在前期研究工作中,我们发现一种模拟人线粒体DNA设计的寡脱氧核苷酸（oligodeoxynueleotide,ODN）即ODN MT01具有较为明确的促进成骨的作用,主要体现为:首先MT01可以通过上调人及大鼠成骨细胞内成骨标志性基因如Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx-2）、I型胶原（Collagen-I,COL-I）和骨保护素（osteoprotegerin,OPG）等m RNA的表达进而促进人及大鼠成骨细胞的成骨向分化;其次,MT01可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,显著抑制大鼠牙周炎导致的牙槽骨缺损,因而,可以推测,MT01在修复骨组织缺损方面具有良好的应用前景。ODN临床应用最为关键的是抵御DNA酶的降解,将其运输到细胞内并与Toll样受体9（Toll like receptor 9,TLR9）结合产生相互作用。MT01作为一种人工合成的ODN具有水溶性好、体内毒性低、与靶位点结合的特异性与敏感性高等优点。但是,由于受到半衰期短和体内核酸酶降解的限制,往往使MT01进入机体后,很快被核酸酶降解吸收进入循环系统,被体内清除和降解,细胞的有效摄取率无法达到阈值水平,影响其功能与作用。对ODN进行化学修饰是有效的抵御DNA酶的方法,然而,国内外的报道表明对核酸主链的修饰可能会产生一系列的副作用,例如减少免疫应答,破坏淋巴滤泡和脾脏肿大、导致肾脏损伤。因此,构建合适的传输体系,以载体递呈的方式取代化学修饰使MT01克服胞外障碍的限制,保护MT01不被胞外核酸酶降解,增强其稳定性,降低其毒副作用,延长作用时间,有效提高其靶向特异性,是开发适于临床应用的MT01的前提和基础。用于基因传输载体主要分为病毒载体和非病毒载体两类。利用病毒载体介导基因转移是基因治疗中应用最广泛的方法,但其潜在的免疫原性和细胞毒性等成为临床应用中存在的安全隐患;同时,该类载体携带DNA容量有限,靶向特异性差,且难以实现大规模制备,以上缺陷均限制了其在临床中的广泛应用。与病毒载体相比,非病毒载体因其安全、有效、无免疫原性、价格低廉等特点,有望成为病毒载体的良好替代者。在非病毒基因载体中,阳离子聚合物聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）由于其能够很容易地与DNA分子组装而备受关注。很多学者使用PEI作为ODN的载体取得了较好的效果。PEI的结构和分子量对其基因转染效率和细胞毒性有着直接的影响,即较高相对分子质量的PEI（大于25KDa）具有较高的转染效率,但同时细胞毒性也较大。相对低分子质量的PEI（小于5KDa）虽细胞毒性较小,但转染效率却很低。因此,以PEI为母体结构,通过合理的分子设计,有效提高基因转染效率同时降低细胞毒性,延长基因体内循环时间,构建理想的传输体系,具有重要的意义。基于以上科学问题,本研究拟采用一种由N-异丙基丙烯酰胺修饰PEI衍生物载体PEN作为MT01的载体,构建PEN/MT01纳米复合物。通过一系列的实验对该复合物的核酸结合能力、材料结构、细胞毒性、基因转染效率进行研究;并采用该复合物转染人成骨样细胞MG63（human osteoblast-like cell line,MG 63）以及修复大鼠颅骨缺损模型,并与游离的MT01和硫代修饰MT01进行对照,利用体内及体外实验评价该复合物促成骨能力。主要研究内容如下:实验一、PEN/MT01纳米复合物的合成及性质表征通过Michael加成反应,使用N-异丙基丙烯酰胺对PEI25K的氨基进行修饰合成PEN。利用静电吸附将PEN与MT01按不同的质量比构建复合物。琼脂糖凝胶电泳检测PEN装载MT01的能力;采用马尔文粒度电位仪检测PEN/MT01纳米复合物的粒径、电位;应用荧光成像、MTT技术检测复合物对MG63细胞转染效率及对细胞增殖情况的影响,筛选最佳转染质量比。结果显示:当PEN与MT01的质量比（w/w）达到0.5:1时,核酸即可被载体完全结合;随着质量比的升高复合物的电荷由负转正,并逐渐升高;其粒径范围在34.8-283.9 nm;扫面电镜显示复合物成球状分布;当复合物质量比（w/w）小于8:1时,没有表现出细胞毒性,而且在质量比为6:1时对细胞的增值有促进作用并有较高的转染效率。综合以上结果,PEN可以作为MT01的高效载体,6:1是PEN与MT01结合的最佳质量比。实验二、PEN/MT01纳米复合物体外促进成骨的能力将质量比为6:1的PEN/MT01复合物转染MG63细胞,使用流式细胞术检测细胞周期的变化;通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测以及realtime-PCR、Western blot技术检测PEN/MT01复合物对MG63细胞内成骨相关因子在基因及蛋白表达水平的改变,探讨对成骨细胞成骨向分化的调控。结果显示:与游离的MT01、硫代修饰的MT01组相比较,使用PEN装载MT01组明显的促进了ALP、OPG、Runx-2等表达并下调RANKL的水平,而且使用载体后可以实现MT01的缓慢释放,提高使用率。实验三、PEN/MT01纳米复合物体内促进成骨的能力制备标准大鼠颅骨临界骨缺损模型,分别于缺损区覆盖载有PBS、游离的MT01、硫代修饰MT01、PEN/MT01复合物的海奥生物膜,10周后处死大鼠,对实验动物模型进行Micro-CT检测和组织学观察并检测大鼠血清生化指标。结果显示:PEN/MT01复合物组缺损区骨缺损处可见与周围宿主骨结合良好,没有见明显的炎症反应,骨新生最为明显,骨骼矿物质密度（BMD）和骨小梁数目（Tb.N）均高于其它组别。以上结果表明:PEN是一种低毒性、高效转染的基因载体;可装载MT01构建PEN/MT01纳米复合物,能够促进骨组织缺损的修复,为MT01用于修复骨组织缺损提供了新的思路。