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有机阴离子转运蛋白(organic anion transporters,OATs)是由超过10种跨膜转运蛋白所组成,是溶质载体超家族中的重要一员,其代表转运蛋白有OAT1、OAT2和OAT3等。有机阴离子转运蛋白1(OAT1)在内源性与外源性的有机离子重吸收及排泄的过程中扮演十分重要的角色,介导许多药物(例如抗生素,非甾体抗炎药,利尿药和抗病毒药等)的代谢产物和跨膜转运。研究发现糖尿病大鼠模型、非酒精性脂肪肝模型、高尿酸血症模型中,OAT1在肾脏组织中表达显著降低,其中在肾小管上皮细胞胞膜表达下降,胞质表达明显增加。此外,在临床糖尿病肾病患者、急性肾损伤患者组织中也发现OAT1的表达水平较低,而病人尿液中OAT1的含量水平显著高于正常组。炎性介质前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)可明显降低大鼠肾脏细胞中OAT1的表达,抑制其转运活性。而已知PGE2与PKA和PKC所介导的信号通路有关,并且其能否影响OAT1的表达,引起OAT1的内吞,以及如何影响尚不清楚。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病,其病因尚未明确。RA是以手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性为主要特征的关节炎症,严重时能够造成关节畸形及功能丧失。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)作为关节炎药物治疗的主要效应细胞之一,在类风湿关节炎中OAT1是否存在表达?其表达变化是如何进行调控的?这些都尚不清楚。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(Paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,代号:CP-25)是一种新的活性单体。前期课题组研究发现CP-25可明显抑制胶原性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠炎症反应,对关节炎具有良好的治疗作用。CP-25可以不同程度地抑制炎性FLS的异常增殖和炎性反应,并且可抑制类风湿关节炎滑膜细胞EP受体异常脱敏,适度恢复滑膜细胞EP4的膜表达。此外,CP-25还可以恢复滑膜细胞中EP4受体介导的信号传导途径,增加细胞内cAMP水平和下游PKA活性。那么CP-25对OAT1的表达是否具有调控作用。研究OAT1的调控机制以及CP-25对其表达的影响有助于深入了解OAT1对药物的转运情况,并且能为药物的今后临床合理使用提供线索。因此,本研究主要考察CP-25对CIA大鼠滑膜组织中OAT1的表达影响,同时研究PGE2是否通过EP4/cAMP/PKA信号通路调控FLS中OAT1的胞膜转运及CP-25的作用。目的:研究CP-25对CIA大鼠滑膜组织中OAT1的表达影响,探讨PGE2是否通过EP4/cAMP/PKA信号通路调控滑膜细胞中OAT1的胞膜表达及CP-25的作用。方法:1)收集临床OA与RA患者的滑膜组织,通过Western blot法检测临床患者滑膜组织中OAT1的表达情况。2)建立大鼠CIA模型,随机分为正常组、CIA模型组、CP-25组(50mg/kg/day)、MTX组(0.5mg/kg/3 day),通过免疫组化法检测OAT1在各组大鼠滑膜组织中的分布和表达;ELISA检测各组大鼠血清中PGE2的水平。3)PGE2 刺激正常大鼠 FLS,分别刺激 0min、5min、10min、20min、30min、60min后,Western blot法检测不同时间PGE2刺激后正常大鼠FLS中OAT1胞膜表达的影响。4)PGE2刺激正常大鼠FLS,采用Western Blotting法检测不同浓度的CP-25(0.1μM、1.0μM、10μM)对PGE2刺激的正常大鼠FLS中OAT1胞质表达的影响;激光共聚焦法检测不同浓度CP-25(0.1μM、1.0μM、10μM)对PGE2刺激的正常大鼠FLS中OAT1的胞膜表达的影响。5)PGE2 刺激正常大鼠 FLS,分为正常组、PGE2(2μM)组、PGE2+CP-25(1.0μM)组、PGE2+CP-25+EP4拮抗剂组,采用激光共聚焦检测方法检测EP4拮抗剂对PGE2诱导的正常大鼠FLS中OAT1的胞膜表达及CP-25的作用。6)siRNA EP4对正常大鼠FLS中OAT1表达的影响,实验分为阴性对照组、siRNA EP4组,采用Western blot法检测各组中OAT1的表达情况。7)PGE2 刺激正常大鼠 FLS,分为正常组、PGE2(2μM)组、PGE2+CP-25(1.0μM)组、PGE2+CP-25+PKA抑制剂(5μM)组,每组给与不同的处理。用Western blot法检测PKA抑制剂对PGE2诱导的正常大鼠FLS中OAT1的胞质表达的影响及CP-25的作用;采用激光共聚焦检测方法检测PKA抑制剂对PGE2诱导的正常大鼠FLS中OAT1的胞膜表达及CP-25的作用。8)PGE2 刺激正常大鼠 FLS,分为正常组、PGE2(2μM)组、PGE2+CP-25(1.0μM)组,每组给与不同的处理。用细胞膜红色荧光探针(Dil)染料定位OAT1在滑膜细胞中的表达和分布。结果:1)RA患者滑膜组织中OAT1的表达水平显著低于OA患者滑膜组织中的OAT1的水平。2)CP-25可以明显降低CIA大鼠的全身评分、关节炎指数和足爪容积等整体指标;CP-25可以明显改善关节炎大鼠踝关节和脾脏组织的病理改变。通过免疫组化法检测各组大鼠滑膜组织中OAT1的分布与表达,我们发现在大鼠的滑膜组织中有OAT1的表达,而且CIA模型组大鼠滑膜组织中OAT1的表达与正常组相比较明显降低,CP-25给药组与MTX给药组的滑膜组织中OAT1的表达与CIA模型组相较明显上调。综上所述,CP-25可以明显减轻CIA模型组大鼠的关节炎临床表现,并且可以上调CIA大鼠滑膜组织中OAT1的异常表达。3)用ELISA检测各组大鼠血清中PGE2的水平,与正常组相比,CIA模型组大鼠血清中PGE2的浓度升高,而CP-25和MTX给药后PGE2浓度降低。4)PGE2(2μM)刺激正常大鼠 FLS,分别刺激 0min、5min、10min、20min、30min、60min后,正常大鼠FLS中OAT1的胞膜表达先下调然后再上调,其中以2μM的PGE2刺激10min后,正常大鼠FLS中OAT1的胞膜表达下调最明显。5)PGE2(2μM)刺激正常大鼠 FLS,不同浓度 CP-25(0.1μM、1.0μM、10 μM)对PGE2刺激的正常大鼠FLS中OAT1的胞质胞膜表达的影响。与正常组相比较,PGE2刺激组中OAT1的胞质表达明显升高,而与PGE2刺激组相比较,不同浓度的CP-25给药后OAT1的胞质表达随浓度的增加而降低;与正常组相比,PGE2(2μM)刺激组中OAT1的细胞膜表达显著降低,而与PGE2(2μM)刺激组相比较,不同浓度的CP-25给药后OAT1的细胞膜表达随浓度的增加而增加。6)PGE2(2μM)刺激正常大鼠FLS,分为正常组、PGE2(2μM)组、PGE2+CP-25(1.0μM)组、PGE2+CP-25+EP4拮抗剂组。与正常组相比较,PGE2(2μM)刺激组OAT1细胞膜表达显著降低,与PGE2(2μM)刺激组相比较,CP-25给药后OAT1细胞膜表达增加,与CP-25给药组相比较,PGE2+CP-25+EP4拮抗剂(5μM)组中OAT1的细胞膜表达降低。7)实验分为阴性对照、siRNAEP4组,干扰组OAT1表达较阴性对照组降低。8)PGE2(2μM)刺激正常大鼠FLS,分为正常组、PGE2(2μM)组、PGE2+CP-25(1.0μM)组、PGE2+CP-25+PKA 抑制剂(5μM)组。与正常组相比较,PGE2(2μM)刺激组OAT1细胞质表达显著增加,与PGE2(2μM)刺激组相比较,CP-25给药后OAT1细胞质表达降低,与CP-25给药组相比较,PGE2+CP-25+PKA抑制剂(5μM)组中OAT1的细胞质表达增加;与正常组相比较,PGE2(2μM)刺激组OAT1细胞膜表达显著降低,与PGE2(2μM)刺激组相比较,CP-25给药后OAT1细胞膜表达增加,与CP-25给药组相比较,PGE2+CP-25+PKA抑制剂(5μM)组中OAT1的细胞膜表达降低。9)与正常组相比较,PGE2(2μM)刺激组OAT1细胞膜表达与分布降低,与PGE2(2μM)刺激组相比较,CP-25给药后OAT1细胞膜表达与分布增加。并且OAT1主要分布在细胞膜上。结论:1)CP-25可以显著上调CIA大鼠滑膜组织中OAT1的表达。2)CP-25可以通过活化PGE2介导的EP4/cAMP/PKA信号通路调控OAT1在FLS中胞膜和胞质的表达。