A群牛轮状病毒（Group A Bovine Rotavirus,BRVA）是重要的犊牛腹泻病原之一。VP6基因是常用的BRVA分子检测靶点,其编码的VP6蛋白也是常用的血清学检测靶蛋白和亚单位疫苗候选抗原。尽管VP6基因是BRVA最保守的结构基因,但也存在遗传变异的现象。因此,监测VP6基因序列的变化对BRVA的检测及防控工作具有重要意义。本实验的目的是在分析国内BRVA VP6分子特征的基础上,表达VP6蛋白并应用于间接ELISA的建立和亚单位疫苗的初步研究,取得如下成果:1.BRVA VP6基因的分子特征采用一对扩增BRVA VP6完整基因的引物,对来自6省区的30份BRVA阳性的MA104细胞培养物进行扩增,成功获得了来自4省区的17条VP6完整基因,片段长度均为1356 bp,均属于I2基因型,编码区核苷酸相似性92.3%¹00%,变异频率为15.37%（183/1191）。所编码的氨基酸相似性98.0%¹00%,变异频率为5.29%（21/397）。进化分析表明,17条核苷酸序列聚为4个小支,其中12株与美国恒河猴源RV株亲缘关系最近;3株与印度牛源RV毒株的亲缘关系最近;1株与中国牛源DQ-75株的亲缘关系最近;1株与日本猫源毒株的亲缘关系最近。进一步分析显示,尽管个别毒株的VP6蛋白存在一定的氨基酸变异,但17个VP6蛋白预测的二级和三级结构没有明显差异,抗原表位预测长度、区域也一致。本实验结果表明,国内BRVA VP6基因的核苷酸存在一定的变异,但对VP6蛋白的抗原性无明显影响,对以VP6为靶基因的分子检测方法研究提供了重要参考,也为后续的VP6蛋白的表达奠定了基础。由于基因重配是轮状病毒重要的进化方式,本实验克隆的17个VP6序列中有13个与非牛源轮状病毒的亲缘关系最近,为进一步研究国内BRVA的遗传进化提供了参考。2.BRVA VP6蛋白的表达和纯化对BRV YG株的VP6 ORF序列进行大肠杆菌密码子偏好性优化后,在两端添加Bam I和Xho I酶切位点,N端添加组氨酸标签,人工合成了BRV YG株的VP6 ORF序列后与pET-28H载体连接,在大肠杆菌Rosetta（DE3）中高效表达了VP6蛋白,纯化后浓度约9 mg/mL。SDS-PAGE结果显示重组蛋白分子大小约44 kD,纯化效果良好,Western Blot结果显示其具有生物活性。本实验成功获得了纯度和生物活性均良好的重组VP6蛋白,为后续建立BRV抗体检测方法和亚单位疫苗的研究奠定了基础。3.基于重组VP6蛋白的间接ELISA试剂盒的研制和应用用纯化的重组BRV VP6蛋白为包被抗原,对抗原包被浓度等反应条件进行优化,成功建立了检测牛血清中BRV抗体的间接ELISA。该方法与牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒抗体均无交叉反应;批内、批间变异系数均低于10%。在此基础上成功组装成间接ELISA检测试剂盒,与西班牙Ingenasa公司的BRVA抗体检测试剂盒符合率为100%,但灵敏度更高。因此,本实验研制的检测BRVA抗体的ELISA检测试剂盒具有特异性和重复性好,敏感性高的特点,可以替代商品试剂盒。对川西北755份牦牛血清检测结果显示BRVA抗体阳性率为99.04%,表明川西北牦牛BRVA感染非常严重。4.重组VP6蛋白亚单位疫苗的免疫效力初步评价为了评价重组BRVA VP6蛋白与粘膜佐剂配制的亚单位疫苗对小鼠的保护作用,在优化VP6蛋白免疫剂量的基础上,以20μg VP6蛋白/只的剂量配制的亚单位疫苗滴鼻免疫母鼠。两次免疫后配种,分别选择免疫母鼠所产的乳鼠和未免疫母鼠所产的乳鼠各8只,每只灌胃200μL BRVA病毒液(10⁷.32.32 TCID₅₀/mL)。结果显示免疫母鼠产下的8只在攻毒后7d内均未出现腹泻,而对照母鼠所产乳鼠在攻毒后3d内腹泻率为100%（8/8）。虽然用荧光RT-PCR在两组乳鼠粪便均检测到BRVA核酸,但病理组织学检查显示免疫母鼠产的乳鼠肠道组织病理变化更轻。这些结果表明,本实验制备的VP6蛋白亚单位疫苗可以使子代鼠通过被动免疫获得一定的保护,为进一步开展VP6蛋白亚单位疫苗对牛的免疫效力实验奠定了基础。