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背景:糖尿病神经病理性疼痛是糖尿病最常见的慢性并发症之一,在临床上多以自发痛、诱发痛、痛觉过敏、痛觉超敏以及异常性疼痛为特征。研究表明,炎症、创伤、缺血缺氧、疼痛、应激等病理状态均可导致中枢神经中胶质细胞的激活,激活后的小胶质细胞表达的P2X4受体在痛觉超敏形成中起重要的作用。作为胞内危险相关分子模式的感受器(danger-associated molecular patterns,DAMPs),P2X4受体是内源性ATP的配体门控性非选择性阳离子通道受体,广泛分布在大鼠脑、脊髓和神经节内,P2X4表达于活化后的小胶质细胞,可激活细胞因子的成熟和分泌,导致机体损伤。然而,在糖尿病状态下,激活态小胶质细胞的P2X4受体在胞内的信号转导机制未明。NLRP3炎性体具有调控机体慢性炎症反应的功能,是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器,是活化caspase-1的分子平台,调控IL-1β和白介素18(interleukin-18,IL-18)等促炎细胞因子的成熟和分泌。P2X4作为神经病理性疼痛的参与者,是否可以通过活化介导ATP等内源性DAMPs激活NLRP3炎性体,调控促炎细胞因子IL-1β的成熟与分泌?Ghrelin是迄今为止发现的唯一的GHS-Rs的内源性配体,其在糖尿病及其并发症的发生机制、炎症反应以及与和疼痛之间的关系等方面的作用逐渐受到研究者的关注。本研究拟建立糖尿病大鼠模型,观察大鼠痛敏与神经损伤的改变,分析糖尿病进程中脊髓Ghrelin与P2X4受体蛋白的变化,初步探讨Ghrelin与P2X4对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的影响机制,并进一步观察Ghrelin对糖尿病神经病理性疼痛的作用,探讨P2X4/NLRP3信号通路在糖尿病神经病理性疼痛发生发展过程中的作用及分子机制,为糖尿病患者神经病理性疼痛的防治提供理论基础。第一部分 Ghrelin与P2X4在糖尿病神经病理性疼痛中的初步机制探讨目的:探讨大鼠糖尿病神经病理性疼痛病程中脊髓P2X4与Ghrelin的表达情况方法:清洁级健康成年雄性SD大鼠24只,采用随机数字表法分为4组(n=6):正常组(N组)、糖尿病2周组(DM2W组)、糖尿病4周组(DM4W组)、糖尿病6周(DM 6W组)。采用腹腔注射1%链脲佐菌素60 mg/kg的方法制备大鼠糖尿病模型。各组大鼠均予正常饮食饲养,分别于第2,4,6周测定大鼠机械痛阈(MWT)及坐骨神经导速率(MNCV);并检测各组大鼠第2,4,6周时脊髓Ghrelin与P2X4的表达情况。结果:与N组比较,DM 2W组即存在MWT明显降低(P<0.01),后续进一步降低;与N组比较,DM 6W组存在MNCV明显降低(P<0.05);与N组比较,DM 2W组大鼠脊髓的Ghrelin与P2X4表达均增强,DM 6W时表达达到高峰。结论:在大鼠糖尿病神经病理性疼痛进程中存在着Ghrelin的代偿性增加与P2X4的过度表达。第二部分 Ghrelin对糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊P2X4/NLRP3表达的影响目的:探讨Ghrelin对糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓P2X4/NLRP3表达的影响。方法:清洁级健康成年雄性SD大鼠24只,采用随机数字表法分为3组(n=8):糖尿病组(DM 组)、糖尿病+Ghrelin 组(DG 组)、糖尿病+Ghrelin+[D-Lys3]-GHRP-6组(DGG组)。[D-Lys3]-GHRP-6为Ghrelin受体GHS-R1α特异性抑制剂,采用腹腔注射1%链脲佐菌素60mg/kg的方法制备大鼠糖尿病模型。DG组于检测糖尿病模型制备成功后,腹腔注射Ghrelin 200μg/kg,持续42d。DGG组Ghrelin 200μg/kg+[D-Lys3]-GHRP-6 50mg/kg 持续 42d。分别于第 2,4,6 周测定大鼠机械痛阈(MWT)及坐骨神经导速率(MNCV),6周后处死大鼠,尼氏体染色观察脊髓病理学变化,电镜观察腓肠神经病理学改变,Western blot法检测脊髓Ghrelin,P2X4,NLRP3,IL-1β。结果:与DM组比较,DG组中脊髓Nissl染色和腓肠神经电镜显示细胞结构正常,MWT和MNCV明显升高,Ghrelin表达升高,P2X4,NLRP3,IL-1β表达降低(P<0.05);与DG组比较,DGG组中脊髓Nissl染色和腓肠神经电镜细胞结构破坏严重,MWT和MNCV明显降低,Ghrelin表达降低,P2X4,NLRP3,IL-1β表达升高(P<0.05)。结论:Ghrelin可能通过P2X4/NLRP3通路参与了糖尿病神经病理性疼痛的调控。