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目的:蛋白质的泛素化和去泛素化的过程广泛存在于人体的各种分子反应中,并与多种疾病的发生发展相关。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes,DUBs）是一种蛋白质去泛素化反应中的关键酶,可从各种底物上裂解小分子泛素（ubiquitin,Ub）以保持蛋白质稳定性。卵巢肿瘤含域蛋白酶-1（ovarian tumor domain-containing protease-1,OTUD1）是 DUBs 的 一种,其在肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）中的作用机制尚不清楚。本研究通过生物信息学的方法筛选在LUAD组织中差异表达的DUBs,通过免疫组化实验对筛选出的差异表达分子OTUD1的表达情况进行验证,并通过细胞功能实验和裸鼠成瘤实验明确OTUD1在LUAD中的生物学功能和分子机制,进而研究OTUD1是否可以作为LUAD诊断的标志物和靶向治疗的潜在靶点。方法:1.候选DUBs的筛选:差异表达的DUBs由GEO数据库的测序数据集筛选得出,使用Oncomine和GEPIA在线生信分析网站验证OTUD1在LUAD中的差异表达情况,并使用Kaplan-Meierplotter数据库对OTUD1的预后价值进行评估。2.验证OTUD1在LUAD组织中的表达:通过免疫组化方法检测92例LUAD患者癌组织和88例对应的癌旁组织中OTUD1的表达情况,同时根据研究对象的临床病理资料评估OTUD1的临床意义。3.细胞功能实验:以pcdna3.1（+）为载体,设计OTUD1过表达质粒,使用lipo3000为转染试剂,在A549和H1299细胞系中进行OTUD1过表达。设计3条小干扰RNA序列,使用RNAiMAX为转染试剂,在H1975细胞系中进行OTUD1敲减。OTUD1的过表达和敲减效率由WB实验检测。通过Transwell侵袭迁移实验,划痕实验和CCK-8增殖实验研究OTUD1在LUAD细胞中的功能。4.PI3K/AKT信号通路功能验证:分别在A549,H1299和H1975细胞系中加入PI3K-IN-1抑制PI3K/AKT通路,观察细胞中PI3K,p-AKT和OTUD1的表达量,验证PI3K/AKT通路是否抑制成功;同时通过CCK-8增殖实验和Transwell实验研究抑制PI3K/AKT通路后LUAD细胞的增殖和转移的是否发生改变。5.研究OTUD1在LUAD中的作用机制:分别在H1299和H1975细胞系中进行OTUD1的过表达和敲减,提取蛋白质后,通过WB实验研究与对照组相比,改变OTUD1的表达后细胞中PI3K,p-AKT分子的表达量的改变,研究OTUD1对PI3K/AKT信号通路的影响。6.OTUD1作用机制的验证:以单纯过表达或敲减OTUD1处理的细胞为对照组,以过表达或敲减OTUD1后抑制PI3K/AKT信号通路的细胞为实验组,设计恢复试验（rescue实验）,通过CCK-8增殖实验和Transwell实验研究过表达或敲减OTUD1后,再抑制PI3K/AKT信号通路,是否会使细胞的增殖和转移发生改变或恢复。7.小鼠成瘤实验验证OTUD1对LUAD肿瘤生长的作用:构建过表达OTUD1的慢病毒,分别用NC和过表达OTUD1的慢病毒转染A549细胞。选择裸鼠进行实验,观察实验组和对照组成瘤的大小,处死小鼠后测量成瘤的质量,并进行统计分析,判断两组小鼠肿瘤的生长是否具有一定的差异。结果:1.使用GEO2R分析GSE19804和GSE27262两个数据集的差异表达基因,并取交集,发现OTUD1在两个数据集中均存在明显低表达,初步筛选出OTUD1作为候选分子进行研究。2.使用Oncomine和GEPIA在线分析工具进行生信分析,验证了 OTUD1在LUAD组织中明显低表达,并通过Kaplan-Meierplotter数据库分析得知,OTUD1的低表达与患者的不良预后有关,具有一定的临床意义。3.通过对92例肺腺癌患者癌组织和88例对应的癌旁组织进行免疫组化实验,证明OTUD1在肺腺癌患者癌组织中存在明显低表达（P<0.01）,符合生信分析预测结果。但OTUD1表达情况与患者的其他临床病理特征,如年龄,性别,TNM分期,ALK突变情况等无明显关联。4.CCK-8增殖实验表明,过表达OTUD1后,A549细胞和H1299细胞的增殖均出现了明显的抑制,以培养48h和72h后表现更为明显。在敲减OTUD1后,H1975细胞的增殖出现了明显的增强,以培养48h和72h后表现更为明显。5.划痕实验和Transwell实验表明,过表达OTUD1后,A549细胞和H1299细胞的侵袭和迁移均出现了明显的抑制。在敲减OTUD1后,H1975细胞的侵袭和迁移出现了明显的增强。6.分别在A549,H1299和H1975细胞系中加入PI3K-IN-1抑制剂,抑制PI3K/AKT信号通路,通过WB实验验证,细胞中OTUD1的表达未发生明显改变,而PI3K和p-AKT的表达发生了明显的下调。CCK-8实验和Transwell实验表明,抑制PI3K/AKT信号通路后,LUAD细胞的增殖和侵袭迁移发生明显下降。证明了 PI3K-IN-1确实能够抑制PI3K/AKT信号通路,并且PI3K/AKT信号通路具有影响LUAD细胞增殖和转移的功能。7.WB实验表明,在H1299细胞系中过表达OTUD1分子48h后,细胞中PI3K和p-AKT分子的表达均明显下降。在H1975细胞系中敲减OTUD1分子48h后,细胞中PI3K和p-AKT分子的表达均明显上升,证明OTUD1分子对PI3K/AKT信号通路存在明显的抑制作用。8.在H1299细胞系中过表达OTUD1后再加入PI3K-IN-1抑制PI3K/AKT信号通路,原本过表达OTUD1导致的LUAD细胞增殖和转移的下降并未出现更进一步的下降;在H1975细胞系中敲减OTUD1后再加入PI3K-IN-1抑制PI3K/AKT信号通路,原本敲减OUTD1导致的LUAD细胞增殖和转移的上升出现了明显的下降,说明OTUD1是通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制LUAD细胞的增殖和转移。9.裸鼠成瘤实验表明,过表达OTUD1后,LUAD的肿瘤大小和质量都明显减低,说明OTUD1在体内能够抑制LUAD的生长,与细胞功能试验结果一致。结论:1.与癌旁组织相比,OTUD1分子在LUAD组织中明显低表达,并且OTUD1的低表达与患者的不良预后有关。2.OTUD1具有抑制LUAD细胞的增殖,侵袭和迁移的功能。3.OTUD1通过抑制PI3K/AKT信号通路,抑制LUAD细胞的增殖和转移。