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【研究背景】阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD,亦称老年性痴呆症）是全世界最常见的神经退行性疾病,主要表现为进行加重的、以记忆障碍为核心的认知功能损害和精神行为异常。其大脑皮质及海马等脑区的核心病理变化包括:细胞内tau蛋白过度磷酸化后聚集而成的双股螺旋细丝（Paired helical filaments,PHFs）,进一步形成神经原纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFTs）、β淀粉样蛋白（β-Amyloid,Aβ）在细胞外沉积形成的老年斑（Senile plaque,SP）。Aβ是由淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）经β-分泌酶（BACE-1）和γ-分泌酶水解后产生的不可溶性多肽。tau是一种微管相关蛋白（Microtubule-associated protein,MAP）,其主要生物学功能是促进微管的组装和稳定。研究表明,NFTs的含量与AD临床痴呆程度成正相关,因此tau蛋白的过度磷酸化和聚集在AD发病及进展中承担重要角色。tau蛋白过度磷酸化是由于大脑中的蛋白激酶和磷酸酶失衡所致,引起tau过度磷酸化的两个关键酶包括蛋白激酶-糖原合成酶激酶3β（Glycogen Synthase Kinase 3 Beta,GSK3β）和磷酸酯酶2A（Protein Phosphatase 2A,PP2A）。脑组织耗氧量高,对缺氧异常敏感,因此缺氧是AD发病的风险因素。低氧诱导因子HIF-1是参与缺氧反应的重要转录因子,由对氧敏感的α亚基和组成性β亚基组成。有研究发现HIF-1的过表达可以导致Aβ含量升高,继而引起阿尔兹海默症病理变化。慢性缺氧时tau磷酸化水平升高,但HIF-1是否参与tau病变的机制尚不清楚。本研究拟明确HIF-1α对tau蛋白关键激酶和磷酸酯酶表达及活性的影响,阐明慢性缺氧条件下HIF-1α介导tau磷酸化的分子机制。【研究目的】探讨慢性缺氧过程中HIF1是否通过调控与tau蛋白过度磷酸化失衡相关的关键激酶GSK3β和磷酸酯酶PP2A的活性,参与tau病变和认知功能障碍,为AD发病机制提供新线索,从而为预防和治疗AD提供新的分子靶标。【研究方法】1.选择经典的缺氧法制备动物模型。将二月龄SD大鼠置于10%O2的缺氧培养箱中,每天处理6h,共一个月,作为慢性缺氧组（hypoxia）。对照组（ctr）不做此处理。每组SD大鼠十二只。通过旷场实验,新物体识别,水迷宫实验,评价大鼠记忆能力。通过Western blotting检测海马内tau不同位点（p S199,p S262,p S396,p S404）磷酸化的表达水平,以及总tau（tau5）和HIF-1α的表达变化,检测GSK3β和PP2A的甲基化水平,并用试剂盒检测PP2A的活性。2.将培养的大鼠原代海马神经元置于1%O2,5%CO2,37℃的培养箱中制备细胞缺氧模型,设立常氧组（即缺氧0h）和慢性缺氧组（缺氧48h）。通过Western blotting检测神经元内tau不同位点（同上）磷酸化的表达水平,以及tau5和HIF-1α的表达变化,及磷酸化修饰的GSK3β以及PP2A的水平,并用试剂盒检测PP2A的活性。3.在大鼠原代海马神经元中,瞬时转染空载或si HIF-1α的慢病毒72h,将细胞分为三组:转染空载病毒后常氧培养组（ctr）,转染空载病毒后缺氧48h组（hypoxia）,下调HIF-1α的表达后缺氧48h组（si HIF-1α+hypoxia）。通过Western blotting检测神经元内HIF-1α表达下调的效率,检测tau不同位点磷酸化的表达水平,以及tau5和PP2A的甲基化水平。4.在大鼠神经胶质瘤细胞（C6细胞）中,瞬时转染全长tau质粒（tau441）48h后,再给予一定浓度氯化钴（Co Cl2）刺激8h。Co Cl2是研究神经退行性疾病建立缺氧模型时常用的造模药物,Co2+通过置换细胞内催化酶中的Fe2+,导致HIF-1表达增多。Western blotting检测细胞内tau不同位点磷酸化的表达水平,以及tau5和HIF-1α的表达变化,并检测PP2A甲基化变化情况。【研究结果】1.在SD模型大鼠中:（1）旷场、新物体识别、水迷宫检测结果显示,慢性缺氧的大鼠的情绪和运动能力没有受到影响,认知功能明显减弱;（2）Western blotting结果显示:相对于对照组,慢性缺氧组大鼠海马tau蛋白磷酸化水平增加,总tau表达水平没有改变;GSK3β表达水平没有改变;PP2A的活性下降,PP2A催化亚基（PP2Ac）的甲基化水平降低;调节PP2Ac甲基化的亮氨酸甲基转移酶（Leucine carboxyl methyltransferase 1）LCMT1表达减少;实验组大鼠HIF-1α表达增加。表明慢性缺氧增加了HIF-1α表达水平,同时通过减少LCMT1的表达降低了PP2Ac的甲基化,从而降低了PP2A的活性,最终导致tau蛋白磷酸化水平增加,引起认知功能障碍。2.在大鼠原代海马神经元中,慢性缺氧48h后,Western blotting结果显示:缺氧组神经元中HIF-1α的表达增加,tau蛋白多个位点磷酸化增加,GSK-3β蛋白水平没有改变,PP2Ac的甲基化水平和活性降低,PP2Ac的甲基转移酶LCMT1表达减少。表明与动物结果一致,慢性缺氧通过增加HIF-1的表达,降低PP2Ac的甲基化,从而导致tau蛋白磷酸化增加。3.在大鼠原代海马神经元中,下调HIF-1α的水平后,Western blotting结果显示:与单纯缺氧组相比,缺氧同时下调HIF-1α表达的神经元中tau蛋白多个位点磷酸化水平降低,PP2Ac的甲基化增加。提示:抑制HIF-1α的表达减轻慢性缺氧导致PP2Ac甲基化水平降低,恢复PP2A活性与tau蛋白磷酸化水平。4.在C6细胞中,给予CoCl28h后,Western blotting结果显示:与对照组相比,Co Cl2处理组中HIF-1α表达增加,tau蛋白磷酸化水平增加,PP2Ac的甲基化水平降低,PP2Ac的甲基转移酶LCMT1表达减少。进一步表明缺氧时HIF-1α下调LCMT1,引起PP2A活性降低,导致tau蛋白过度磷酸化。【结论】慢性缺氧可能通过上调HIF-1a,减少LCMT1,导致PP2Ac甲基化水平下调、活性降低,引起tau异常过度磷酸化。