【摘 要】
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a-淀粉酶（a-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶,EC3.2.1.1）催化水解淀粉,糖原和麦芽糖的a-D-（1,4）-糖苷键,随机地作用于淀粉的非还原端,生成麦芽糖,麦芽三糖,糊精等还原糖。该蛋白广泛分布于细菌,古细菌和真核生物中。由于其广谱的淀粉水解活性,不仅在食品工业中具有较高应用价值,而且在医疗、日用化工及饲料等方面也发挥着重要的作用。目前工业途径获得的a-淀粉酶主要是从微生物中提取,但在饲
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a-淀粉酶（a-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶,EC3.2.1.1）催化水解淀粉,糖原和麦芽糖的a-D-（1,4）-糖苷键,随机地作用于淀粉的非还原端,生成麦芽糖,麦芽三糖,糊精等还原糖。该蛋白广泛分布于细菌,古细菌和真核生物中。由于其广谱的淀粉水解活性,不仅在食品工业中具有较高应用价值,而且在医疗、日用化工及饲料等方面也发挥着重要的作用。目前工业途径获得的a-淀粉酶主要是从微生物中提取,但在饲料应用上都存在着成本高和使用安全性等问题。通过生物技术手段,将猪自身的基因克隆到微生物体内,诱导表达生产a-淀粉酶具有产量高、生产工艺简单、生产成本较低等优点,颇有发展前途。 本研究的目的就是试图通过基因工程手段,利用微生物生产一种高效价廉的重组猪的胰腺a-淀粉酶产品。编码PPA基因全长的cDNA序列以RT-PCR法从猪胰腺细胞中克隆并将其连接到表达载体质粒pPICZaA得到重组质粒pPICZaA-PPA,经Sac I酶切线性化切开后,通过电穿孔法将线性重组质粒整合到毕赤酵母X-33染色体上,利用含不同浓度Zeocin的YPDS平板对转化子进行抗性筛选。采用实时定量PCR对mRNA表达量高的转化子进行筛选,RNA表达量高的转化子进行BMGY摇瓶培养后于BMMY用甲醇进行诱导,在醇氧化酶1（AOX1）强启动子的作用下,实现了PPA在毕赤酵母中的表达。用Ni Sepharose High Performance亲和层析柱纯化重组蛋白,目的蛋白经SDS-PAGE检测后确定约为58kDa的重组表达产物,与预期目的蛋白产物大小基本相符。重组蛋白酶学特性测定显示：最适pH和温度分别是：7.5和55℃；米氏常数Km和最大反应速度分别为：48.8mg/ml和1.3mg/min在50℃恒温水浴30min酶活损失近50%;对金属离子的抑制性试验发现,Cu2+（0.08 mMol/1）对重组蛋白的抑制作用明显强于Fe3+（24m Mol/1）, Ca2+（15m Mol/1）, Zn2+（12m Mol/1）。通过对比重组蛋白和胰腺提取蛋白发现,二者是在酶学特性上是十分相似的。说明重组PPA在毕赤酵母中获得了成功的表达。
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