随着人类工业水平的不断提高,为了满足不同生产生活需求,越来越多化学品被合成并运用到各个领域。然而,这些化学品在满足人们需求的同时,也在不知不觉中给人类以及动物健康带来了风险。对羟基苯甲酸异丁酯(Isobutylparaben,IBP)是一种人工合成的化学品,由于价格低廉且具有很好的抗菌能力,被广泛应用于护理产品、医药、饲料、造纸、印刷等领域。近年来的研究表明,IBP是一种具有雌激素活性的内分泌干扰物,会对生物体的生殖健康构成潜在威胁。然而,雌性动物卵母细胞是否也会受这种化合物的影响以及会产生何种影响还未见报道。本课题利用猪卵丘卵母细胞复合体的体外成熟培养体系,研究了不同浓度IBP(0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L)对猪卵母细胞成熟的急性毒性影响,并进一步探讨了其可能的影响机制,包括卵丘扩展、细胞骨架分布、氧化应激、早期细胞凋亡和组蛋白甲基化修饰。研究结果如下:(1).IBP抑制猪卵母细胞卵丘扩展和第一极体排放:在猪卵丘卵母细胞复合体体外成熟培养的过程中,添加不同浓度的IBP,经过44h成熟培养发现,随着IBP浓度的升高,猪卵母细胞第一极体排放(PBE)比率呈现线性下降趋势(r=0.8410)。虽然0.1 mmol/L的IBP对猪卵母细胞第一极体排放比率没有显著影响(P>0.05)。但是0.2 mmol/L的IBP却可以显著抑制卵母细胞的第一极体排放(P<0.05),0.4 mmol/L的IBP对卵丘细胞扩展产生明显的抑制作用。上述结果说明,IBP可以通过抑制卵丘细胞扩展和第一极体排放影响猪卵母细胞成熟。0.4 mmol/L IBP既可以抑制卵丘细胞拓展又允许排放少量的第一极体,有利于开展相关机制的探究,因此后续试验选择此浓度探究对猪卵母细胞成熟的潜在影响。(2).IBP可破坏猪卵母细胞骨架:猪卵母细胞与0.4 mmol/L IBP共培养27h,利用免疫荧光染色α-tubulin微管蛋白以检测纺锤体的组装情况。结果显示,对照组猪卵母细胞大部分呈现正常的双极纺锤体形态。而处理组猪卵母细胞纺锤体出现单极和多极化形态,纺锤体异常比率显著增加(P<0.05)。此外,对微丝进行免疫荧光染色发现,对照组猪卵母细胞的微丝主要集中在皮质区,呈圆环状。而处理组猪卵母细胞的微丝在皮质区域荧光信号显著减弱(P<0.05),主要分布在细胞质。说明IBP破坏了纺锤体正常组装和微丝在皮质区域的分布,影响了猪卵母细胞的细胞骨架。(3).IBP可以引起卵母细胞氧化应激和细胞凋亡:猪卵母细胞与0.4 mmol/L IBP共培养27h,利用活性氧检测试剂盒DCHF-DA检测猪卵母细胞活性氧水平。结果显示,对照组猪卵母细胞大部分无绿色荧光(绿色荧光强弱体现活性氧水平高低),而处理组大部分猪卵母细胞出现了强烈的绿色荧光,经过荧光信号检测扫描发现荧光强度显著增强(P<0.05),说明IBP可以引发猪卵母细胞氧化应激。利用Annexin V-FITC凋亡检剂盒检测猪卵母细胞早期凋亡情况发现,对照组猪卵母细胞极少出现早期凋亡的绿色荧光,而处理组中一部分猪卵母细胞皮质外围出现了早期凋亡绿色荧光。经过统计分析发现早期凋亡比率出现了显著升高(P<0.05),说明IBP可以诱导猪卵母细胞早期凋亡,影响猪卵母细胞的存活。(4).IBP处理可改变猪卵母细胞表观遗传学修饰:猪卵母细胞与0.4 mmol/L IBP共培养27h,利用免疫荧光染色技术检测猪卵母细胞中组蛋白H3K9me3和H3K27me3的荧光强度,结果发现对照组大部分猪卵母细胞H3K9me3和H3K27me3显示出微弱的红色荧光,而处理组大部分猪卵母细胞H3K9me3、H3K27me3的红色荧光显著增强。经过荧光信号检测扫描发现,处理组相比于对照组荧光信号平均水平显著增加(P<0.05)。这一结果提示,IBP可改变猪卵母细胞表观遗传学修饰。本实验研究结果表明:0.1 mmol/L IBP不会对猪卵母细胞卵丘扩展和第一极体排放产生明显影响,0.2 mmol/LIBP可显著抑制猪卵母细胞第一极体排放,0.4mmol/L的IBP可抑制卵丘颗粒细胞扩展,同时0.4 mmol/L IBP通过破坏卵母细胞纺锤体组装,扰乱微丝在皮质区域的分布,诱导氧化应激和凋亡以及改变表观遗传学修饰的方式来影响猪卵母细胞的成熟过程。